線粒體途徑在幽門螺桿菌VacA誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：本研究初步探討幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)空泡毒素單一毒力決定簇對(duì)GES-1胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究H. pylori的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將本課題組已構(gòu)建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至GES-1細(xì)胞中，Western-blot鑒定VacA蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)；電子顯微鏡和中性紅攝取試驗(yàn)檢測(cè) GES-1細(xì)胞的空泡樣變；

2、Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒以及電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)采用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度，羅丹明123檢測(cè)細(xì)胞跨膜電位的變化， ELISA法檢測(cè)細(xì)胞色素C的釋放。
　　結(jié)果：重組質(zhì)粒pDsRed-Monomer-C1/VacA轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞后，顯示有特異性表達(dá)條帶，24h后電鏡下可明顯觀察到空泡樣變及核固縮、染色質(zhì)邊聚等凋亡特征；重組質(zhì)粒組中性

3、紅攝取量明顯升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hoechst33342染色后鏡下可見明顯的核染色質(zhì)濃縮，轉(zhuǎn)染24h后Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。Caspase-9和Caspase-3活化程度呈時(shí)間依賴性增加，分別在12h和24h達(dá)到峰值。Rho123染色發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電位明顯降低，同陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組釋放細(xì)