5-FU富集支氣管上皮細胞株干細胞群體的分子機制研究.pdf

1、先天性氣管狹窄或閉鎖、肺部惡性腫瘤使氣管的結構和功能造成嚴重損傷，需外科重建。但異種移植無法避免排斥反應，需終生應用免疫抑制劑，增加了感染及患腫瘤的危險性。如能使用氣管干細胞移植，重建完整的氣管上皮，則給上述患者的治療帶來希望。
　　 我們的研究組利用5-FU制作了氣管的損傷、修復模型。Oct3/4、Nanog和Sox2在正常的支氣管上皮為陰性表達。在5-FU處理之后，正常的增殖期氣管上皮脫落，僅有少量GO期細胞保留在基底膜上，

2、此時出現(xiàn)Oct3/4、Nanog和Sox2的陽性表達。隨后，Oct3/4、Nanog和Sox2陽性的細胞逐漸增多。當細胞分化為纖毛細胞、粘液細胞或基底細胞時，重建了假復層纖毛柱狀上皮，而Oct3/4、Nanog和Sox2陽性細胞逐漸減少，最終消失。我們認為體細胞Oct3/4、Nanog和Sox2由陰變陽，可能發(fā)生了再編程，而后干細胞分化為纖毛細胞、粘液細胞或基底細胞，此時Oct3/4、Nanog和Sox2由陽變陰，再現(xiàn)了干細胞分化過程。

3、并提出Oct3/4、Nanog和Sox2為氣管干細胞的標志物，那么為什么在損傷修復過程中出現(xiàn)有規(guī)律的變化呢？進一步的研究證明，在5-FU處理后，體細胞Oct3/4、Nanog和Sox2的DNA啟動子發(fā)生去甲基化，組蛋白乙?；?，染色質(zhì)重塑，這些已在大鼠及人支氣管器官實驗中得到證明。本研究觀察經(jīng)5-FU處理后，富集分離人支氣管上皮細胞株中的干細胞，并解析干細胞的生物學特點。
　　 材料和方法：
　　 一、材料與試劑
　

4、　 人支氣管上皮細胞株HBE由本實驗室培養(yǎng)傳代，實驗中所用為生長狀況良好的細胞。細胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。BALB/c Nu裸鼠，雄性5～6周，16～18克，購自上海茂生生物科技發(fā)展有限公司。無支原體胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、MTT、5-FU、Hoechst33342、Verapamil、PI、Giemsa染色液、Oct3/4單克

5、隆抗體、Sox2單克隆抗體、P63單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體、Alpha fetoprotein單克隆抗體、人肌動蛋白actin(SM)單克隆抗體、人微管蛋白Ⅲ單克隆抗體、免疫組織化學染色試劑盒、4，6-diamidino-2-phenylindole、TRITC標記的山羊抗兔IgG、TRITC標記的兔抗山羊IgG、TRITC標記的山羊抗小鼠IgG、EGF、bFGF、胰島素、ECL化學發(fā)光試劑盒、Western細胞裂解液、

6、考馬斯亮藍。
　　 二、方法
　　 1、MTT實驗
　　 將單個細胞懸液接種于96孔板中，每孔含103個細胞，培養(yǎng)24h，空白孔和對照孔分別加入200ul培養(yǎng)基，干預孔加入化療藥物和培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至干預后的相應時間點進行OD值的測定。每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO，490nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細胞的空白孔做對照。計算抑制率，繪制細胞生長曲線。
　　 2、流式細胞儀分選SP細胞<

7、br>　　 消化細胞成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1×106/mL，待分選細胞分兩組處理：一組避光加入終濃度為5μg/ml Hoechst33342，另一組在避光加入終濃度為5μg/mlHoechst33342的同時，加入50μmol/L的維拉帕米(verapamil)作為對照。避光37℃孵育90min。孵育過程中每15min要充分混勻細胞。90min后，細胞4℃離心，1000rpm離心10min，重懸于含2% FBS的冰PBS中，加入

8、終濃度為2μg/ml的PI，標記死細胞。流式細胞儀分選SP細胞：Hoechst33342染料在350 nm處被激發(fā)，發(fā)射光藍光424nm/BP44，紅光660nm/BP20。
　　 3、細胞免疫熒光
　　 將細胞接種于24孔板中培養(yǎng)生長。貼壁后按40μg/ml的濃度加入5-FU，24 h后測免疫熒光。4%多聚甲醛室溫固定15min。Triton X-100處理，血清封閉后分別滴加Oct3/4，Sox2，P63，β-cat

9、enin-抗，4℃孵育過夜。避光加入TRITC標記的熒光二抗，DAPI復染細胞核后，倒置熒光顯微鏡BX51(Olympus，Tokyo，Japan)觀察結果。
　　 4、Western印跡實驗
　　 收集5-FU作用前后的HBE細胞，按蛋白抽提試劑盒說明抽提細胞總蛋白，加入1×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5min，離心后上樣。12%SDS-PAGE電泳分離，恒壓濕轉(zhuǎn)膜120mins，含5%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉2h

10、rs，一抗分別用Oct3/4、Sox2、P63、β-catenin和β-actin，4℃孵育過夜。HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或兔抗山羊IgG或山羊抗小鼠IgG作為二抗，室溫孵育2hrs，洗膜后，ECL化學發(fā)光法顯影成像。相同條件下用β-actin作為內(nèi)對照。
　　 5、集落形成實驗
　　 消化細胞成單細胞懸液，將細胞做梯度倍數(shù)稀釋，按每皿50、100、200個細胞的密度分別接種于含10 ml37℃預溫的培養(yǎng)液中。在37℃

11、、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。14天后，終止培養(yǎng)，加入純甲醇5 ml，固定15 min。去固定液，加Giemsa應用染色液染30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。計算克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%
　　 6、無血清+生長因子懸浮培養(yǎng)富集干細胞
　　 HBE細胞用5-FU(40μg/ml)處理48h后，棄去加藥培養(yǎng)液，消化成單細胞懸液。按1×104個/ml接種于含EGF20ng/ml、bFG

12、F20ng/ml和胰島素4μg/ml的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。每2天加1次生長因子，1周換液2次，培養(yǎng)2周。每天觀察經(jīng)5-FU處理前后的HBE細胞在無血清培養(yǎng)液中形成干細胞球的過程。
　　 7、裸鼠移植實驗
　　 選擇5周齡的雄性裸鼠，5-FU處理前后細胞按5×105個/200μl PBS，進行接種。每周觀察2次，移植4周后給裸鼠施行安樂死。稱量腫瘤大小，重量，拍照。腫瘤切取后常規(guī)4%多聚甲醛固定，石蠟包

13、埋，制作病理切片，HE染色，免疫組織化學染色。
　　 8、HE染色
　　 標本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片。二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，蘇木素染核，鹽酸酒精分化。自來水沖洗返藍20min，伊紅染色。梯度酒精脫水，透明，中性樹膠封片。
　　 9、組織切片免疫組化
　　 標本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片。經(jīng)脫蠟，脫苯，水化后，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法(

14、S-P法)檢測組織中Oct3/4、P63、Alpha fetoprotein、classⅢβtubulin、肌動蛋白actin的蛋白表達情況。
　　 10、免疫熒光雙染
　　 將細胞接種于24孔板中培養(yǎng)生長。貼壁后按40μg/ml的濃度加入5-FU，24 h后測免疫熒光。4%多聚甲醛室溫固定15min。Triton X-100處理，小牛血清封閉后分別滴加Oct3/4-抗工作液，4℃孵育過夜。避光加入TRITC標記的熒光二

15、抗，馬血清封閉后分別滴加二標一抗(H3K4Me2，H3K9Ace，H3K9Me3，H3K27Me3，HP1-α，PML)，37℃孵育2.5h。避光加入FITC標記的二標熒光二抗，37℃孵育1h。DAPI復染細胞核后，倒置熒光顯微鏡BX51(Olympus，Tokyo，Japan)觀察結果。
　　 11、透射電鏡觀察
　　 取1mm×1mm×1mm大小組織，2.5%戊二醛固定24h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切

16、厚度為50～70nm的切片，甲苯胺藍染色，電鏡觀察、拍片、記錄。
　　 12、統(tǒng)計學處理
　　 數(shù)據(jù)至少經(jīng)過3次實驗獲得，采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進行分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果：
　　 一、5-FU對HBE細胞增殖的影響
　　 利用MTT的方法來分析5-FU對HBE細胞增殖的影響。不同濃度的5-FU作用于HBE細胞后，細胞生長有不同程度的抑制，這種抑制呈時間劑量依賴

17、性。我們選用5-FU40μg/ml作用24h來進行后續(xù)的實驗。
　　 二、5-FU作用后流式細胞儀分析SP細胞比例增多
　　 加入PI染料排出死細胞和細胞碎片后，對5-FU作用前后的HBE細胞進行了SP細胞分選。P3門顯示的SP細胞，能排出Hoechst33342染料。在正常的HBE細胞中，SP細胞占0.5%；當同時加入verapamil孵育30分鐘后，SP細胞的比例下降到0.2%。經(jīng)5-FU處理后，SP細胞增加為0.8

18、%，當同時加入verapamil孵育30分鐘后，SP細胞的比例下降到0.2%。經(jīng)5-FU處理后，SP細胞的比例明顯增加。
　　 三、細胞免疫熒光
　　 1、5-FU作用后出現(xiàn)胚胎干細胞的標記物陽性表達
　　 為了檢測胚胎干細胞的標記物，對5-FU處理前后的細胞進行了Oct3/4和Sox2的免疫熒光染色分析。Oct3/4和Sox2陽性表達為核呈現(xiàn)明亮紅色染色。在正常的HBE細胞中，Oct3/4為幾乎為陰性表達；在5

19、-FU作用后，出現(xiàn)了Oct3/4的陽性表達。Sox2的表達與Oct3/4是一致的。
　　 2、5-FU作用后出現(xiàn)分化的標記物P63的低表達
　　 眾所周知，HBE細胞表達分化的標記物P63。在正常的HBE細胞中，有P63的高陽性表達；在5-FU作用后，P63的表達明顯降低，證實在5-FU作用后，出現(xiàn)了未分化的狀態(tài)。
　　 3、β-catenin的表達
　　 Wnt信號通路在控制干細胞的自我更新方面起著重要

20、作用，β-catenin是Wnt信號通路的一個關鍵因子。未經(jīng)5-FU作用的HBE細胞，β-catenin主要為胞膜和胞漿表達；在5-FU作用后，β-catenin出現(xiàn)表達增加并表現(xiàn)為核表達。
　　 四、Western blot分析
　　 在正常的HBE細胞中，Oct3/4，Sox2，β-catenin為低表達；而經(jīng)5-FU處理后，表達水平升高。P63在正常的HBE細胞中高表達，經(jīng)5-FU處理后表達水平下降。
　　

21、 五、5-FU作用后，克隆形成能力增強
　　 對5-FU作用前后的HBE細胞按材料和方法所述進行了克隆形成能力的檢測。原始的HBE細胞的克隆形成率為7%。而經(jīng)5-FU處理后的細胞克隆形成率增加了2.5倍，達到了18%。并且形成的克隆體積更大，Giemsa染色更深。
　　 六、5-FU作用后，干細胞球形成能力增強
　　 HBE經(jīng)5-FU作用48h后，大部分細胞死亡，僅有一少部分細胞保存了下來。存活下來的細胞用胰酶消

22、化后加無血清培養(yǎng)液和生長因子懸浮培養(yǎng)，觀察了干細胞球的形成能力。經(jīng)5-FU作用前后的HBE細胞按10000個/ml的密度接種。培養(yǎng)2周后從單細胞懸液形成的懸浮干細胞球可以看出未處理的分化的HBE細胞表現(xiàn)為低干細胞球形成能力，而5-FU作用后出現(xiàn)高的干細胞球形成能力，同時該細胞球與HBE細胞球相比，球體較大，折光性強，細胞間連接更緊密，難以區(qū)分細胞間界限。這些都說明了存活下來的細胞有較高的自我更新能力。七、5-FU作用后，富集干細胞群體獲

23、得畸胎瘤形成能力
　　 為了比較5-FU作用前后HBE細胞是否有多分化能力，我們按5×105個細胞進行裸鼠移植。在移植后4周，裸鼠被處死，對腫瘤進行稱重，拍照，HE染色。HBE細胞移植組沒有腫瘤形成，經(jīng)5-FU作用后的細胞移植組都觀察到腫瘤形成。經(jīng)HE染色及免疫組化染色證實該腫瘤為畸胎瘤。HE染色可見多層鱗片狀上皮細胞(外胚層)、平滑肌(中胚層)、腺上皮(內(nèi)胚層)組織。免疫組織化學染色結果可見classⅢβtubulin陽性表達

24、為神經(jīng)樣細胞，SM陽性表達為平滑肌樣細胞。其中畸胎瘤有三個胚層分化?；チ龅男纬勺C實了其多能性。而干細胞巢呈現(xiàn)Oct3/4染色陽性，說明為富含干細胞的未分化組織。透射電鏡觀察該細胞核較大，核內(nèi)常染色質(zhì)多，均勻分布；異染色質(zhì)很少，未凝集成塊。細胞漿少，細胞間連接少見。提示該細胞為未分化的幼稚細胞。八、Oct3/4陽性細胞與陰性細胞組蛋白修飾、染色質(zhì)狀態(tài)比較
　　 基因組的表達分析說明了干細胞的分化很可能與異染色質(zhì)的增多有關。為了了

25、解在5-FU作用前后染色質(zhì)狀態(tài)的變化，我們先用Western blot的方法分析了特異性的組蛋白修飾的抗體。最近的研究說明H3K4Me2和H3K9Ace是轉(zhuǎn)錄后活性的標記物；而H3K9Me3和H3K27Me3是轉(zhuǎn)錄后抑制性標記物。
　　 接下來，我們用相應的特異性抗體與Oct3/4做了免疫熒光雙染。在Oct3/4(+)的細胞中，H3K4Me2和H3K9Ace的表達也為陽性。在Oct3/4(-)的細胞中，H3K4Me2和H3K9A

26、ce的表達也喪失。H3K9Me3和H3K27Me3是在Oct3/4(-)的細胞中出現(xiàn)，在Oct3/4(+)的細胞中喪失。在Oct3/4與組蛋白修飾之間的特異性聯(lián)系說明組蛋白修飾與Oct3/4基因的染色質(zhì)形成有關。
　　 PML小體是參與核轉(zhuǎn)錄的因子，并與某些基因富集的常染色質(zhì)區(qū)域相聯(lián)系。為了檢測HP1-α與PML在這個過程中是如何表達的，做了Western blot和免疫熒光雙染分析。Western blot的結果顯示HP1-α

27、與PML蛋白在正常的HBE細胞中低表達，而在5-FU作用后的細胞中高表達。免疫熒光雙染顯示HP1-α在Oct3/4(+)的細胞中出現(xiàn)，而在Oct3/4(-)的細胞中消失。PML小體與組蛋白的乙?；D(zhuǎn)移酶相關，在5-FU作用后Oct3/4(+)細胞中數(shù)量較多，可達到15～20個；而在正常的Oct3/4(-)的細胞中，PML小體的數(shù)量較少，僅有3～5個。PML小體與Oct3/4細胞的特異性聯(lián)系說明PML小體也與Oct3/4基因的染色質(zhì)形成有

28、關。
　　 結論：
　　 1、經(jīng)5-FU處理后，支氣管上皮細胞中SP細胞增加，出現(xiàn)胚胎干細胞的陽性表達，克隆形成率提高，裸鼠移植后畸胎瘤形成率增高。本研究證明5-FU處理后能富集支氣管上皮細胞株中干細胞群體。
　　 2、表觀遺傳修飾支持Oct3/4可為氣管干細胞標記物。
　　 3、5-FU作用支氣管上皮細胞后，組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑調(diào)控內(nèi)源性Oct3/4轉(zhuǎn)錄激活，從而富集氣管干細胞。
　　 4、經(jīng)