供體氣管上皮細胞的凋亡促進阻塞性細支氣管炎的發(fā)生及機制研究.pdf

1、肺移植是治療多種終末期肺部疾病的有效方法，但肺移植患者術后的生存情況不佳，移植術后患者的生存率遠低于心、肝、腎等其他實體器官移植。接受肺移植的成年患者五年生存率只有53％。肺移植后病人長時間存活的主要障礙是阻塞性細支氣管炎綜合征(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS)。BOS的組織學標志是阻塞性細支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB)。OB是一個炎性細胞浸潤和纖維

2、化的過程，其特征是粘膜下的纖維化導致的部分或完全的氣道阻塞。阻塞性細支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB)是導致存活時間大于1年的肺移植患者死亡的主要原因。大約有50%的成年肺移植患者在術后5年內會出現(xiàn)BOS。一旦確診BOS，那么病人的中位生存時間大約只有2.5年。雖然目前肺保存技術、外科手術技術和免疫抑制治療有了很大提高，但OB的治療效果仍然欠佳。肺移植后OB的發(fā)生危害了患者的肺功能，降低了其生活質量

3、，所以進一步探明OB的發(fā)病機制，并在此基礎上尋找有效的治療方法，可以改善肺移植患者的預后，并能推動肺移植手術的推廣。
　　OB的病理生理機制復雜，這也是肺移植患者預后欠佳的重要原因。眾所周知，氣管上皮細胞是肺移植后異種免疫的主要攻擊靶點，而且上皮細胞的損傷引起了一系列的反應，最終導致OB的發(fā)生，上皮細胞的損傷是OB發(fā)生發(fā)展的始發(fā)因素。有研究表明上皮細胞的凋亡與OB的發(fā)生有關。Hansen等發(fā)現(xiàn)患有OB的肺移植病人的氣管組織中凋亡上

4、皮細胞的數(shù)量比對照組多，而且凋亡上皮細胞的數(shù)量與肺移植患者發(fā)生OB的易感性呈正相關。
　　OB的病理特征顯示上皮細胞和上皮下結構的損傷和炎癥導致了過量的纖維性增生。在OB的發(fā)生發(fā)展過程中大量的細胞外基質沉積于氣管腔，并且肌成纖維細胞是OB過程中細胞外基質產生的主要細胞，其數(shù)量在OB時出現(xiàn)了增加。外周血中來源于骨髓的纖維細胞是一種特殊形式的間充質干細胞。這些纖維細胞是肌成纖維細胞的來源之一。它們在遷移到目標區(qū)域后能夠分化為肌成纖維細

5、胞。然而，氣管上皮細胞的凋亡與移植物中肌成纖維細胞數(shù)量的關系卻仍有爭論。我們通過建立性別錯配的骨髓移植模型，獲得了骨髓組織表達Y染色體的嵌合體小鼠，從而能夠標記骨髓來源的間充質干細胞。以嵌合體小鼠為受體，行原位氣管移植，探討氣管上皮細胞凋亡對受體骨髓組織中間充質干細胞的作用、氣管上皮細胞凋亡與移植物中骨髓來源的肌成纖維細胞的數(shù)量之間的關系以及可能的機制。
　　本研究包括以下兩部分：第一部分：嵌合體小鼠的構建；第二部分：供體氣管上皮

6、細胞凋亡促進阻塞性細支氣管炎的發(fā)生及相關機制。
　　第一部分：嵌合體小鼠的構建
　　背景：要研究骨髓來源的細胞在阻塞性細支氣管炎（obliterative bronchiolitis, OB）形成過程中的遷移情況，首先需要對骨髓細胞進行標記。Y染色體標記法是通過骨髓移植將雄性動物的細胞移植到雌性動物體內，獲得性別錯配的嵌合體動物，以雄性動物特異性的Y染色體對細胞進行標記，這種方法實驗操作簡單，并且標記的效果確切。在移植骨髓細

7、胞前需要對受體動物進行清髓性致死性的全身照射。而致死性的照射不僅破壞了實驗動物的骨髓微環(huán)境，而且使受體動物發(fā)生了放射性損傷。間充質干細胞能夠協(xié)同促進造血干細胞移植。間充質干細胞能夠分化成造血微環(huán)境的不同細胞成分，從而促進了造血功能的恢復。我們的研究試圖探明將骨髓細胞和骨髓間充質干細胞共移植能否減輕放射性損傷加快造血功能的恢復。
　　方法：首先分離雄性C57BL/6小鼠的骨髓細胞，在體外條件下培養(yǎng)得到骨髓間充質干細胞。雌性 C57B

8、L/6小鼠接受致死量全身照射（8Gy）后，經尾靜脈給不同分組的小鼠注射不同的細胞成分。對照組小鼠注射0.2 ml PBS；骨髓細胞組小鼠注射0.2 ml含1×107骨髓細胞的PBS；骨髓間充質干細胞組小鼠注射0.2 ml含1×106骨髓間充質干細胞的PBS；骨髓細胞+骨髓間充質干細胞組小鼠注射0.2 ml含1×107骨髓細胞和1×106骨髓間充質干細胞的PBS。在移植后的第1、2、4周分別取受體小鼠的外周血，提取基因組DNA后行熒光定量

9、PCR檢測Y染色體特異性基因SRY，計算受體小鼠外周血單核細胞中的雄性細胞的比例（嵌合率），比較不同小組的嵌合率水平。
　　結果：所有對照組小鼠在移植后的2.5周內死亡，在移植后第1和第2周無SRY基因的表達。骨髓細胞組小鼠的嵌合率逐漸增長并最終達到90%以上。單純間充質干細胞組小鼠有2只死亡，該組小鼠的嵌合率雖然有所增加，但一直處于較低水平。骨髓細胞+間充質干細胞組小鼠的嵌合率逐漸增加，并達到了90%以上，并且嵌合率的增加速度和

10、放射相關并發(fā)癥的恢復速度比骨髓細胞組小鼠更快。
　　結論：通過本部分實驗我們建立了改良的骨髓移植模型，在骨髓移植時將骨髓間充質干細胞和骨髓細胞共移植時，受體小鼠的造血功能恢復更快，且放射相關并發(fā)癥的恢復也更快。從而能更好地獲得骨髓細胞含有Y染色體的嵌合體小鼠，為進一步研究骨髓來源的細胞在氣管移植后的遷移和作用奠定了基礎。
　　第二部分：供體氣管上皮細胞凋亡促進阻塞性細支氣管炎的發(fā)生及相關機制
　　背景：肺移植是多種終末

11、期肺疾病的唯一有效的治療手段，但肺移植病人的遠期生存情況卻不令人滿意，成人肺移植患者的五年生存率只有53%。造成這種情況的主要原因是阻塞性細支氣管炎的發(fā)生。對生存時間大于1年的肺移植患者而言，其最常見的死亡原因就是阻塞性細支氣管炎。臨床上，我們稱阻塞性細支氣管炎為阻塞性細支氣管炎綜合征（bronchiolitis obliterans syndrome, BOS）。在首次接受肺移植的受體中術后5年內有大約50%的受體罹患了BOS。然而，

12、目前針對阻塞性細支氣管炎的治療措施卻不能有效的預防其發(fā)生和發(fā)展。氣管上皮細胞凋亡通過一系列反應啟動了阻塞性細支氣管炎的發(fā)生。我們的研究試圖探討供體氣管上皮細胞的凋亡能否促進受體骨髓來源的細胞轉化為肌成纖維細胞，進而參與OB的發(fā)生發(fā)展及相關機制。
　　方法：建立小鼠原位氣管移植模型，分別以雌性C57BL/6和BALB/c小鼠為供體，嵌合體小鼠為受體進行氣管移植。在移植后的第1，2，3，4周取移植氣管，對氣管組織行石蠟包埋后切片，對切

13、片行 HE染色后分析氣管腔阻塞情況。對切片行免疫熒光雙標染色分析上皮細胞凋亡情況及骨髓來源的肌成纖維細胞。以免疫組織化學方法檢測移植物中SDF-1α和TGF-β的表達，以及CD4+和CD8+T細胞的浸潤情況。
　　結果：在氣管移植模型中，與對照組相比，同種異體移植物中凋亡的氣管上皮細胞更多，且在不同的時間點同種異體移植物的氣管腔阻塞率更高。氣管上皮細胞凋亡發(fā)生的時間比氣管腔阻塞發(fā)生的時間更早。在氣管移植后的第2到第4周同種異體移植

14、物中骨髓來源的肌成纖維細胞的數(shù)量也比對照組多。同種異體移植物中SDF-1α和TGF-β的含量也比對照組高。在氣管移植后的第1周 CD4+T細胞數(shù)量最多，之后稍有減少，移植后第1到4周CD8+T細胞的浸潤在同種異體移植物中逐漸增多，而在對照組中其浸潤較為輕微且未隨時間延長出現(xiàn)增多。
　　結論：我們的實驗表明OB的發(fā)生過程中凋亡的氣管上皮細胞可能增加了骨髓來源的肌成纖維細胞。骨髓來源的細胞可能在SDF-1α的作用下遷移到移植物中，在T