香煙煙霧凝集物誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)的機(jī)制.pdf

1、吸煙是呼吸系統(tǒng)疾病的重要危險(xiǎn)因素。香煙煙霧刺激正常人呼吸道上皮細(xì)胞，可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)的表達(dá)增加。IL-8基因順式調(diào)控元件內(nèi)有包括核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear faetor-κB，NF-κB)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-β(CCAAT/enhanccr binding protein-β，C/EBPβ)在內(nèi)的多個(gè)核因子結(jié)合位點(diǎn)。但有關(guān)NF-κB和C/EBPβ在香煙煙霧誘導(dǎo)IL-8基因轉(zhuǎn)錄活

2、化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用尚不清楚。
　　 目的
　　 該研究用香煙煙霧凝集物(cigarette smoke extracts，CSE)刺激人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞，觀察CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的損害作用和對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-8表達(dá)的影響。利用IL-8促進(jìn)子上的NF-κB，C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)突變細(xì)胞株(IL-8mNF-κB-BEAS-2B cells，IL-8mC/EBPβ-BEAS-2B cells)，

3、細(xì)胞中被激活的NF-κB，C/EBPβ不能與IL-8促進(jìn)子結(jié)合。通過比較CSE刺激后，NF-κB，C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)突變BEAS-2B細(xì)胞與野生型BEAS-2B細(xì)胞(IL-8 WT BEAS-2Bcells)中與IL-8促進(jìn)子相連的熒光素酶(luciferase，fLCF)基因表達(dá)量的變化，觀察NF-κB和C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子在CSE引起的入支氣管上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)變化中的作用。為進(jìn)一步探討吸煙導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)炎癥發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.CSE溶液的配制
　　 CSE原液的制備參照Su Y的方法并改良，CSE原液用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，配制好的CSE于30min之內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.MTT比色法測(cè)CSE溶液對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度
　　 用0％、2.5％、5.0％、7.5％、10.0％、12.5％的CSE溶液刺激BEAS-2B細(xì)胞，測(cè)定不同濃度的CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的抑制作用，并得出C

5、SE溶液的半數(shù)抑制濃度。
　　 3.CSE處理正常BEAS-2B細(xì)胞及IL-8基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)
　　 根據(jù)MTT測(cè)定的結(jié)果，分別以濃度0％、2.5％、5.0％、7.5％、10.0％的CSE作用正常BEAS-2B細(xì)胞，通過熒光定量PCR，分析不同濃度CSE處理后細(xì)胞IL-8 mRNA水平的變化。
　　 4.CSE處理3種突變型BEAS-2B細(xì)胞及其fLCF mRNA表達(dá)水平檢測(cè)
　　 根據(jù)CSE處理

6、正常BEAS-2B細(xì)胞后IL-8基因表達(dá)的變化，用7.5％CSE作用3種突變型BEAS-2B細(xì)胞，通過熒光定量PCR，分析CSE處理后，細(xì)胞fLCFmRNA水平的變化。
　　 5.熒光素酶活性測(cè)定
　　 以試劑盒中報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照，測(cè)定7.5％CSE作用的正常BEAS-2B細(xì)胞和3種突變型BEAS-2B細(xì)胞的熒光素酶活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.BEAS-2B細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
　　

7、CSE刺激支氣管上皮細(xì)胞來源的BEAS-2B細(xì)胞，可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)改變。CSE處理后，細(xì)胞胞漿疏松，漂浮細(xì)胞增多。隨著CSE濃度的增加，細(xì)胞受損情況也越嚴(yán)重。
　　 27.5％CSE處理3種突變型BEAS-2B細(xì)胞，細(xì)胞綠色熒光的變化
　　 3種突變型BEAS-2B細(xì)胞受到CSE作用后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光細(xì)胞減少，細(xì)胞回縮變圓。
　　 3.MTT檢測(cè)結(jié)果
　　 CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)

8、胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，F(xiàn)=25.06，P<0.001。且隨著藥物濃度的增加，CSE對(duì)細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為7.5％。
　　 4.BEAS-2B細(xì)胞IL-8 mRNA在不同濃度CSE作用后的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　 CSE作用BEAS-2B細(xì)胞，可導(dǎo)致其炎癥因子IL-8表達(dá)增加，單因素方差分析表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1808.1，P<0.001)。低濃度(

9、2.5％、5.0％和7.5％)的CSE刺激增加IL-8 mRNA的表達(dá)(P<0.001)，且具有濃度依賴性增高；但是10.0％CSE處理組大量細(xì)胞死亡，其IL-8 mRNA表達(dá)量與無CSE處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5.7.5％CSE作用3種突變型BEAS-2B細(xì)胞fLCF mRNA的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　 7.5％CSE作用后，IL-8mNF-κB-BEAS-2B細(xì)胞和IL-8mC/EBPβ-

10、BEAS-2B細(xì)胞的fLCF mRNA表達(dá)量都較IL-8 WT BEAS-2B細(xì)胞低，且IL-8 WT BEAS-2B細(xì)胞fLCF mRNA表達(dá)量是IL-8mNF-κB-BEAS-2B細(xì)胞fLCF mRNA表達(dá)量的1.32倍，是IL-8mC/EBPβ-BEAS-2B細(xì)胞的fLCFmRNA表達(dá)量的1.54倍。
　　 6.熒光素酶活性測(cè)定
　　 相同濃度和作用時(shí)間的CSE刺激，IL-8mNF-κB-BEAS-2B細(xì)胞和IL-