膠霉毒素誘導(dǎo)支氣管上皮細胞凋亡及對相關(guān)凋亡基因、凋亡蛋白表達的影響.pdf

1、目的：通過煙曲霉感染人支氣管上皮細胞體外模型，觀察細胞培養(yǎng)上清液膠霉毒素水平和人支氣管上皮細胞的相關(guān)凋亡基因、凋亡蛋白及凋亡率的改變來探討膠霉毒素在人支氣管上皮細胞煙曲霉感染中的作用及其機制。
　　方法：（1）菌株的培養(yǎng)：將煙曲霉菌接種到PDA瓊脂平板，置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3-4天，連續(xù)活化兩次，PBS重懸孢子并計數(shù)。（2）野生型人支氣管上皮細胞（HBE）的培養(yǎng)：將支氣管上皮細胞以密度為106/ml接種于直徑10cm培養(yǎng)皿中，每

2、皿加入5ml細胞懸液，再加入新鮮含10％FBS培養(yǎng)液后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。（3）共培養(yǎng)模型的建立：當(dāng)細胞密度為80%以上時，按1:1000（菌孢子數(shù):支氣管上皮細胞數(shù)）加入菌懸液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3h，PBS沖洗，棄上清液，加入一定量的RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。（4）結(jié)果的測定：分別于共培養(yǎng)12h、24 h、36 h終止實驗，收集細胞培養(yǎng)上清液和支氣管上皮細胞，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

3、（LC-MS）、RealTime-PCR、Wester-Blot和流式細胞儀（Annexin V-FITC法）技術(shù)，檢測各共培養(yǎng)模型中上清液膠霉毒素的水平及支氣管上皮細胞相關(guān)凋亡基因、凋亡蛋白的變化及凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）測定膠霉毒素水平結(jié)果顯示：與對照組（共培養(yǎng)模型0h時間點，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)組上清液膠霉毒素水平隨時間逐漸升高

4、（P<0.05）；AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清液組未檢測到膠霉毒素。AF293單獨培養(yǎng)組及AF293支氣管上皮細胞共培養(yǎng)組上清液膠霉毒素水平隨時間逐漸升高（P<0.05），在36h時間點AF293支氣管上皮細胞共培養(yǎng)組膠霉毒素水平高于AF293單獨培養(yǎng)組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　2. RT-PCR檢測支氣管上皮細胞相關(guān)凋亡基因結(jié)果顯示：與對照組（共培養(yǎng)模型0h時間點，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，各共培養(yǎng)組細

5、胞bc l-2凋亡基因表達水平呈逐漸降低（P<0.05），Bak凋亡基因表達水平呈逐漸升高（P<0.05）；將 AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)組分別與AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)比較，在36h時間點凋亡基因bcl-2、bak表達水平均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.005）。
　　3. Wester-Blot檢測支氣管上皮細胞凋亡蛋白結(jié)果顯示：與對照組（共培養(yǎng)模型0h時間點，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，各共培養(yǎng)組細胞bc

6、l-2凋亡蛋白合成水平呈逐漸降低（P<0.05），Bak凋亡蛋白合成水平呈逐漸升高（P<0.05）；將 AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)組分別與AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)比較，在36h時間點凋亡蛋白bcl-2、bak合成水平均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.005）。
　　4.流式細胞儀檢測支氣管上皮細胞凋亡率結(jié)果顯示：與對照組（共培養(yǎng)模型0h時間點，煙曲霉呈孢子狀態(tài)）相比，各共培養(yǎng)組細胞凋亡率呈逐漸升高（P<0.05

7、）；將AF B5233ΔGlip共培養(yǎng)組分別與AF293共培養(yǎng)組及AF B5233 WT共培養(yǎng)比較，在36h時間點細胞凋亡率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.005）。
　　結(jié)論：
　　1.膠霉毒素在支氣管上皮細胞煙曲霉感染過程中發(fā)揮著重要作用。
　　2.膠霉毒素可誘導(dǎo)支氣管上皮細胞凋亡，且 Bak、Bcl-2可能是膠霉毒素在支氣管上皮細胞煙曲霉感染過程中發(fā)揮作用的重要位點。
　　3.支氣管上皮細胞煙曲霉感染過程中煙曲霉可