JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在赭曲霉毒素A誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞（HKC）凋亡中的作用.pdf

1、目的：赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OA)是自然界中的一種真菌毒素，主要由赭曲霉和青霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生，廣泛存在于谷物和食品中，是一種具有致畸性、致突變性和致癌性的真菌毒素。目前己有研究表明，OA具有腎臟毒性、肝臟毒性和免疫毒性，尤其是其腎臟毒性比較明顯，主要表現(xiàn)為腎小管變形退化、進(jìn)行性腎纖維化和腎功能的損害，被認(rèn)為是巴爾干腎病和慢性間質(zhì)性腎炎的主要病因之一。 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-termin

2、al kinase，JNK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，大量實驗提示JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可被細(xì)胞因子、生長因子、應(yīng)激等多種因素激活，在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種人類疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。目前，有關(guān)OA腎毒性機(jī)理的研究多集中在OA和DNA形成DNA加合物導(dǎo)致DNA的損傷、斷裂以及OA抑制線粒體的氧化呼吸鏈方面，而有關(guān)JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在OA誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)凋亡中作用

3、的研究未見報道。 鑒于此，本實驗采用細(xì)胞培養(yǎng)、MTT比色法、流式細(xì)胞定量檢測技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白印跡等方法探討JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在OA誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用，揭示OA的腎毒性機(jī)制。 方法 1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理HKC細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、10<'5>U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。 選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞(傳代后24h)隨機(jī)

4、分為空白對照組、溶劑對照組、OA處理組。OA處理組加入乙醇溶解液，終濃度為1μM和5μM，空白對照組加入生理鹽水，溶劑對照組加入乙醇(1：500)。常規(guī)消化、離心收集細(xì)胞，檢測各項指標(biāo)。 2 噻唑藍(lán)(MTT)比色法2．1 MTT比色法用于檢測OA對細(xì)胞生長的影響。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞(傳代后24h)隨機(jī)分為四組：空白對照組、溶劑對照組、1μM和5μM OA處理組，每組6孔。在OA處理組中，分別給予上述細(xì)胞4h、8h、16h、24

5、h、48h的處理時間。根據(jù)MTT檢測結(jié)果，觀察OA處理對人腎小管上皮細(xì)胞HKC生長的影響，并依此篩選出最佳的處理時間，作為本實驗的處理時間。 2．2 選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為四組：空白對照組、溶劑對照組、1μMOA處理組和JNK阻斷劑組(JNK特異性阻斷劑-SP600125 0.5μM+OAlμM)，每組6孔。JNK阻斷劑組給予SP600125預(yù)處理30min后，再加入1μM OA處理細(xì)胞24h，觀察SP600125對OA作

6、用后HKC細(xì)胞存活率的影響。 3 流式細(xì)胞定量檢測技術(shù)(FCM)給予不同濃度OA處理后，F(xiàn)CM檢測人腎小管上皮細(xì)胞HKC細(xì)胞凋亡率。 4 免疫細(xì)胞化學(xué)(SP法)細(xì)胞爬片后，檢測OA處理后人腎小管上皮細(xì)胞HKC中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)以及JNK、p-JNK的表達(dá)情況。 5 蛋白免疫印跡(Western Blotting)提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白印跡方法，檢測OA處理后人腎小管上皮細(xì)胞HKC中凋亡相關(guān)蛋白

7、caspase-3的表達(dá)情況及JNK、p-JNK的表達(dá)情況。 結(jié)果 1 OA對體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞生長的影響MTT檢測結(jié)果表明，OA對HKC細(xì)胞的生長有一定抑制作用：給予1μM、5μMOA分別處理4h、8h、16h、24h、48h后，各時間點HKC細(xì)胞存活率均較對照組(100％)降低，尤其以24h OA處理組細(xì)胞的存活率降低更明顯(P<0.05)，1μM、5μN(yùn)OA處理24h細(xì)胞存活率分別為51.09％，53.38％。根據(jù)

8、MTT檢測結(jié)果，選擇24h作為本研究的處理時間。 2 OA對體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞凋亡的影響2.1 FCM檢測細(xì)胞凋亡率FCM DNA定量檢測結(jié)果顯示，HKC細(xì)胞經(jīng)OA處理24h后，1μM、5μMOA處理組細(xì)胞凋亡率分別為3.85±0.29％和4.86±0.51％，均高于對照組(1.23±0.05％)(P<0.05)。 2.2 凋亡相關(guān)蛋白-Caspase-3的表達(dá)2.2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測Caspase-3蛋白表達(dá)C

9、aspase-3蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，定位于HKC細(xì)胞胞漿內(nèi)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見，1μM和5μM OA處理組Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為54.03±9.21％、60.75±9.95％，較對照組(14.31±4.24％)顯著增加(P<0.05)。 2.2.2 蛋白免疫印跡檢測Caspase-3蛋白表達(dá)Caspase-3蛋白分子量為32kD，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，空白對照組、溶劑對照組、OA處理組均在32kD位置出

10、現(xiàn)了棕色的陽性條帶。以β-aetin(42KD)作為內(nèi)參照，采用圖像分析系統(tǒng)對雜交條帶進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，OA處理可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)。 3 OA對體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞磷酸化JNK(p-JNK)表達(dá)的影響。3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測p-JNK的表達(dá)p-JNK定位于HKC細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見，1μM、5μM OA處理組p-JNK陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為53.31±11.01％和58

11、.53±11.11％，明顯高于對照組(10.19±6.85％)(P<0.05) 3.2 蛋白免疫印跡檢測p-JNK的表達(dá)p-JNK是JNK的活化形式，由p-JNK1、p-JNK2、p-JNK3組成。p-JNK1蛋白分子量為54kD；p-JNK2、p-JNK3蛋白分子量為46kD，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，HKC細(xì)胞空白對照組、溶劑對照組、OA處理組均在54kD、46kD位置出現(xiàn)了兩條棕色的陽性條帶。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)對雜交條帶

12、進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，OA處理可以使HKC細(xì)胞p-JNK表達(dá)增高。 4 OA對體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞JNK表達(dá)的影響。4.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測JNK的表達(dá)JNK定位于HKC細(xì)胞胞漿內(nèi)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見，與對照組相比，1μM和5μM OA處理組JNK陽性細(xì)胞表達(dá)率無明顯變化(P>0．05)。 4．2 蛋白免疫印跡檢測JNK的表達(dá)JNK由JNK1、JNK2、JNK3組成，JNK1蛋白分子量為54kD，JNK2、JNK3蛋白分子

13、量為46kD。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，HKC細(xì)胞對照組、OA處理組均在54kD、46kD位置出現(xiàn)了棕色的陽性條帶。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)對雜交條帶進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步證實給予OA處理后，體外培養(yǎng)的HKC細(xì)胞JNK的表達(dá)無明顯變化。 5 JNK特異性阻斷劑-SP600125對OA處理后HKC細(xì)胞存活率的影響MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JNK阻斷劑組(SP600125預(yù)處理+OA)HKC細(xì)胞的存活率(82.09％)明顯高于OA處理組66.8

14、3％(P<0.05)，但低于溶劑對照組(98.58％)(P<0.05)，說明SP600125對OA致HKC細(xì)胞損傷具有部分阻斷作用，提示OA可能通過JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與介導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程。 結(jié)論 1 OA可以促進(jìn)體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 2 OA可以促進(jìn)體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞p-JNK的表達(dá)，提示JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與OA誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡。 3 SP600125