ERK和p38MARK信號通路參與赭曲霉毒素A誘導的人胃黏膜上皮細胞(GES-1)G2期阻滯的研究.pdf

1、目的：赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由益霉菌屬和青霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生的一種真菌毒素，其污染非常普遍，在糧食作物和食品中存在非常廣泛。OTA的主要毒性作用器官是腎臟，OTA可能是巴爾干地方性腎病的主要致病原，1993年國際癌癥研究中心IARC將OTA列為“可能的人類致癌物”。除外腎毒性，動物實驗研究還發(fā)現(xiàn)OTA具有免疫毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、致突變性、致畸性和致癌性等生物效應。長期食用OTA污染的飼料，可以誘發(fā)F34

2、4/N大鼠出現(xiàn)前胃上皮細胞增生和乳腺纖維腺瘤。由于在食物中分布的廣泛性，人類很容易長期暴露于OTA的毒性環(huán)境中。
　　研究表明一些真菌毒素的早期毒性作用是通過引起凋亡、增殖抑制或者周期阻滯，比如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及煙曲霉毒素B1。我們實驗室前期研究工作發(fā)現(xiàn)，OTA通過下調人胃黏膜上皮細胞周期調控關鍵蛋白(Cdc25C、Cdc2和CyclinB1)的表達引起細胞G2期阻滯，提示OTA可通過G2期阻滯來發(fā)揮其部分毒性作用

3、，在中國倉鼠肺成纖維細胞(V79)及非洲綠猴腎臟細胞(CV-1)中，OTA也通過導致G2期阻滯來發(fā)揮其毒性作用。
　　絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)是細胞內重要的信號轉導系統(tǒng)之一，參與細胞的各種生理及病理活動，包括細胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成員為ERK(細胞外信號調節(jié)激酶)通路，JNK/SAPK(c-Jun氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶)通路

4、和p38 MAPK通路。研究表明在各種刺激因素的作用下，細胞可以通過激活或抑制MAPK信號通路而啟動細胞G2期檢測點，使細胞發(fā)生G2期阻滯。Yang等人發(fā)現(xiàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇介導的G2/M阻滯是通過ERK1/2信號通路增強p21水平實現(xiàn)的。然而，目前有關OTA誘導人胃黏膜上皮細胞G2阻滯的相關分子機制尚不明了。
　　鑒于MAPK信號通路在細胞周期中的重要作用，我們提出這樣的假設，即MAPK信號通路可能參與OTA誘導的人胃黏膜上皮細

5、胞G2期阻滯。為驗證本假設，本實驗將觀察JNK、ERK和p38 MAPK信號通路在OTA誘導的G2期阻滯中的作用，以期揭示OTA誘導體外人胃黏膜上皮細胞G2期阻滯的可能分子機制。
　　方法：
　　1細胞培養(yǎng)與處理
　　正常人胃黏膜上皮細胞(GES-1)培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2培養(yǎng)，細胞貼壁生長。
　　選擇對數(shù)生長期的細胞(傳代后24

6、 h)隨機分為溶劑對照組和實驗組。實驗組給予OTA，使其終濃度分別為5、10、20μM，溶劑對照組給予終濃度為0.08％的甲醇(每組設平行樣本3個)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細胞進行相關指標檢測。
　　2阻斷劑處理
　　對數(shù)生長期GES-1細胞，分別給予10μM SB203580(p38的阻斷劑)或者10μM PD98059(ERK的阻斷劑)預處理30 min。實驗分為4組，即溶劑對照組、阻斷劑組、OTA處理組和阻斷劑+OTA處

7、理組。細胞處理24 h后收集細胞檢測相關指標。
　　3 siRNA轉染
　　分別用100 pmol ERK和p38特異性siRNA轉染細胞，再加入20μMOTA繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細胞進行相關指標檢測。同時轉染Negtive controlsiRNA(NC siRNA)作為陰性對照。檢測ERK和p38基因被干擾后對OTA誘導的G2期阻滯的影響。
　　4流式細胞術檢測細胞周期(FCM)
　　OTA作用24h后，分別

8、收集各組細胞，PBS洗滌，離心收集細胞，用70％冰乙醇固定檢測細胞周期分布情況。
　　5蛋白免疫印跡(Western blot)
　　OTA處理GES-1細胞24h后，提取細胞總蛋白，用蛋白免疫印跡方法，檢測OTA處理后人胃黏膜上皮細胞GES-1中JNK/磷酸化型JNK、ERK/磷酸化型ERK和p38/磷酸化型p38以及G2期調控蛋白的表達情況。
　　6免疫共沉淀(IP)
　　提取細胞總蛋白，120μg各組蛋白加

9、入1μg CyclinB1抗體4℃搖床過夜，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測Cdc2-CyclinB1復合物的形成情況
　　7統(tǒng)計
　　采用SPSS13.0軟件進行相關分析與單因素方差分析(analysis ofvariance，ANOVA)，數(shù)據(jù)用x-±s表示，檢驗以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結果：
　　1 OTA對體外培養(yǎng)GES-1細胞JNK、ERK和p38信號通路的影響
　　1.1 OTA使GES-

10、1細胞內的ERK和p38磷酸化水平升高，對JNK無影響
　　Western blot結果顯示，OTA5、10和20μM處理24 h后，p38和ERK磷酸化水平明顯高于溶劑對照組(P＜0.05)，而JNK磷酸化蛋白相對表達量與溶劑對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。同時，各OTA處理組細胞內非磷酸化p38、ERK和JNK蛋白水平均未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。
　　1.2 ERK和p38阻斷劑可對抗OTA引起的ERK和p

11、38磷酸化水平的升高
　　結果顯示，與OTA20μM處理組相比，ERK的磷酸化水平在PD98059+OTA組明顯降低(P＜0.05)。同樣的，SB203580預處理也逆轉了OTA引起的p38磷酸化水平的升高(P＜0.05)。
　　以上結果表明，OTA處理可以激活GES-1細胞內的p38和ERK信號通路，而對JNK通路并未造成影響。
　　2阻斷ERK信號通路對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響
　　2.1

12、ERK特異性阻斷劑(PD98059)預處理對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響
　　FCM結果顯示，PD98059預處理+OTA20μM組G0/G1期細胞比例較20μM OTA單獨處理組明顯增加，G2/M期細胞比例則顯著降低(P＜0.05)。表明PD98059可以部分逆轉OTA誘導的GES-1細胞G2阻滯。
　　2.2 ERK siRNA干擾對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響
　　FCM研究結果發(fā)現(xiàn)，

13、NC siRNA處理組與溶劑對照組細胞周期分布無明顯差異(P＞0.05)。ERK siRNA轉染則可以顯著逆轉OTA對GES-1細胞周期的影響，即顯著了升高G0/G1期細胞比例，降低了G2/M期細胞的比例(P＜0.05)。表明ERK siRNA轉染可部分逆轉OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。
　　上述結果表明ERK信號通路參與OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。
　　3阻斷p38信號通路對OTA誘導的GES-1細胞G2

14、期阻滯的影響
　　3.1 p38特異性阻斷劑(SB203580)預處理對OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯的影響
　　FCM結果發(fā)現(xiàn)，SB203580預處理對細胞周期的影響類似于PD98059，即與OTA20μM處理組相比，SB203580預處理降低了GES-1細胞的G2/M期細胞比例(P＜0.05)。表明SB203580可以部分逆轉OTA誘導的GES-1細胞G2阻滯。
　　3.2 p38 siRNA干擾對OTA誘導

15、的GES-1細胞G2期阻滯的影響
　　FCM研究結果發(fā)現(xiàn)，NC siRNA處理組細胞周期分布與溶劑對照組相比無明顯差異(P＞0.05)。而p38 siRNA轉染則顯著逆轉了OTA導致的G2期阻滯(P＜0.05)。
　　以上結果證明p38信號通路參與OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。
　　4阻斷ERK信號通路對OTA誘導的GES-1細胞G2期調控蛋白的影響
　　4.1 ERK特異性阻斷劑(PD98059)預處理

16、對GES-1細胞G2期調控蛋白的影響
　　Western blot結果顯示，與20μM OTA處理組相比，PD98059預處理+OTA20μM組G2期相關蛋白(Cdc25C、Cdc2和CyclinB1)及磷酸化形式的Cdc25C和Cdc2的表達明顯增加(P＜0.05)。
　　IP結果顯示，PD98059預處理GES-1細胞同時增加了Cdc2-CyclinB1復合物的形成(P＜0.05)。
　　表明PD98059預處理可

17、逆轉OTA對GES-1細胞G2期調控蛋白表達降低的影響。
　　4.2 ERK siRNA干擾對GES-1細胞G2期調控蛋白的影響
　　Western blot檢測結果顯示，ERK siRNA轉染可對抗OTA引起的Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白表達的下降(P＜0.05)。NC siRNA處理組細胞內上述蛋白的相對表達量與溶劑對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。
　

18、　IP結果顯示，NC siRNA處理組細胞內Cdc2-CyclinB1復合物與溶劑對照組相比沒有明顯差別(P＞0.05)，而與OTA20μM處理組相比，ERKsiRNA+OTA20μM處理組Cdc2-CyclinB1復合物明顯增多(P＜0.05)。
　　以上結果提示，ERK信號通路通過調控G2期調控蛋白(Cdc25C、Cdc2和CyclinB1)的表達參與OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。
　　5阻斷p38信號通路對GE

19、S-1細胞G2期調控蛋白的影響
　　5.1 p38特異性阻斷劑(SB203580)預處理對GES-1細胞G2期調控蛋白的影響
　　Western blot結果顯示，SB203580預處理+OTA20μM組與20μMOTA處理組相比，Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白的表達明顯增加(P＜0.05)。
　　另外，IP結果顯示，與OTA20μM處理組相比，SB203580預處

20、理+OTA20μM處理組Cdc2-CyclinB1復合物明顯增多(P＜0.05)。
　　5.2 p38 siRNA干擾對GES-1細胞G2期調控蛋白的影響
　　Western blot檢測結果顯示，NC siRNA處理組細胞內Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白相對表達量與溶劑對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。而p38 siRNA轉染后可以對抗OTA引起的上述蛋白的下降(

21、P＜0.05)。
　　IP結果顯示，Cdc2-CyclinB1復合物在NC siRNA處理組與溶劑對照組相比沒有明顯差別(P＞0.05)，而p38 siRNA轉染顯著逆轉了OTA20μM引起的Cdc2-CyclinB1復合物的降低(P＜0.05)。
　　以上結果提示，p38 MAPK信號通路通過調控G2期調控蛋白(Cdc25C、Cdc2和CyclinB1)的表達參與OTA誘導的GES-1細胞G2期阻滯。
　　結論：

22、r>　　1赭曲霉毒素A作用于GES-1細胞24 h，可以激活ERK和p38 MAPK信號轉導通路，對JNK信號通路并未造成影響。
　　2阻斷ERK和p38 MAPK信號通路可對抗赭曲霉毒素A對GES-1細胞的G2期阻滯作用。
　　3阻斷ERK和p38 MAPK信號通路可對抗赭曲霉毒素A對G2期調控關鍵蛋白(Cdc2/p-Cdc2、Cdc25C/p-Cdc25C、CyclinB1)和Cdc2-CyclinB1復合物的降低作用。