赭曲霉毒素A誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及可能機(jī)制的研究.pdf

1、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生的一種真菌毒素，1993年國(guó)際癌癥研究中心IARC將OTA列為“可能的人類致癌物”。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OTA具有腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、致畸性、致突變性和致癌性等生物學(xué)效應(yīng)。河北省贊皇縣是我國(guó)胃癌高發(fā)區(qū)，胃癌年均死亡率超過(guò)為77.67/10萬(wàn)。2006年，我們對(duì)當(dāng)?shù)鼐用窦Z食中OTA的污染狀況進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，OTA檢出率為45.16％，最高含量為

2、14.25μg/kg，當(dāng)?shù)鼐用馩TA的周暴露量為8.19μg/kg，明顯超過(guò)世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會(huì)(Joint FAO/WHO ExpertCommittee on Food Additives，JECFA)暫定的每周允許攝入量100 ng/kg。有關(guān)OTA研究最為廣泛的是在腎毒性或致癌性方面，本實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)，OTA可以誘導(dǎo)人胃粘膜上皮(GES-1)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷以及細(xì)胞周期紊亂;OTA可以導(dǎo)致人外周血單個(gè)核細(xì)

3、胞的氧化應(yīng)激損傷。越來(lái)越多的體外和體內(nèi)的研究證明氧化應(yīng)激在OTA的毒性和致癌作用方面具有重要作用。
　　大量研究認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷是啟動(dòng)和促進(jìn)腫瘤發(fā)生的重要因素。當(dāng)各種外源或內(nèi)源性因素引起的活性氧(ROS)超過(guò)體內(nèi)的清除能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致ROS水平升高，使細(xì)胞內(nèi)的一些生物大分子（DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等）受到損傷，即發(fā)生氧化應(yīng)激。在體內(nèi)或體外模型研究中對(duì)許多的分子機(jī)制進(jìn)行了抗氧化作用研究通過(guò)消除OTA誘導(dǎo)的DNA損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化作用，以

4、及細(xì)胞毒性進(jìn)一步確認(rèn)的OTA毒性和氧化損傷之間的聯(lián)系。有關(guān)OTA的毒性和OTA誘導(dǎo)腎癌形成提出的多種機(jī)制:抑制蛋白質(zhì)的合成，干涉代謝系統(tǒng)，增加膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制線粒體呼吸和DNA損傷。我們?cè)谇捌诘难芯恐幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)急性染毒OTA后，人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1內(nèi)ROS水平明顯升高，引起細(xì)胞氧化DNA損傷。但是目前有關(guān)OTA是否可以誘導(dǎo)GES-1惡性轉(zhuǎn)化及氧化應(yīng)激是否參與其中并不清楚。
　　近年來(lái)有研究顯示氧化應(yīng)激在Wnt信號(hào)通路的激

5、活以及上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起了至關(guān)重要的作用。β-catenin一方面和E-cadherin結(jié)合形成復(fù)合體，與微絲、中間絲、肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架相連，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，參與調(diào)控細(xì)胞分化和組織發(fā)生;另一方面，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)扮演轉(zhuǎn)錄因子的角色，β-catenin磷酸化阻止其與α-catenin的結(jié)合，導(dǎo)致其堆積于細(xì)胞核內(nèi)，此過(guò)程會(huì)降低細(xì)胞間黏附，同時(shí)β-catenin作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，它的表達(dá)增加

6、可以激活Wnt信號(hào)通路的下游分子。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中不可缺少的通路。有研究表明，飲水中砷、鉻誘導(dǎo)大腸癌發(fā)生的潛在機(jī)制就是ROS介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活;ROS導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。我們不禁思考一個(gè)問題:OTA誘導(dǎo)的人胃黏膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激是否參與介導(dǎo)了Wnt信號(hào)通路的激活以及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化？
　　鑒于此，本研究利用永生化人正常胃黏膜上皮細(xì)胞(GES

7、-1)作為研究對(duì)象，研究和探討OTA長(zhǎng)期染毒對(duì)GES-1細(xì)胞遷移、侵襲和克隆形成能力等方面的影響，并通過(guò)接種裸鼠成瘤進(jìn)一步證明是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。利用Western blot印跡等技術(shù)探討長(zhǎng)期暴露OTA后對(duì)GES-1細(xì)胞上皮性蛋白表達(dá)的影響;接著以Wnt/β-catenin通路作為切入點(diǎn)，利用蛋白印跡等技術(shù)揭示W(wǎng)nt通路在OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用;然后基于抗氧化策略的實(shí)施，評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激對(duì)Wnt/β-catenin通路及細(xì)胞

8、惡性轉(zhuǎn)化的影響，從整體水平觀察OTA對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞的損傷作用，為揭示OTA與胃癌發(fā)生的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分赭曲霉毒素A長(zhǎng)期染毒誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化
　　目的:探討赭曲霉毒素A誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的GES-1細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的可能性，分析OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1分組及處理:在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以長(zhǎng)期染毒方法探討OTA處理誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化作用。實(shí)驗(yàn)分為OT

9、A處理組和對(duì)照組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞，用10％ DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×104個(gè)/L，接種于培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，給予2.5μmol/L OTA處理72h，一周一次，染毒直至40代。2惡性轉(zhuǎn)化的評(píng)價(jià):2.1采用形態(tài)學(xué)觀察OTA處理后細(xì)胞變化，劃痕實(shí)驗(yàn)于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，Transwell實(shí)驗(yàn)在高倍鏡下計(jì)數(shù)PET膜下面侵襲的細(xì)胞數(shù)，軟瓊脂克隆觀察細(xì)胞錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)能力;2.2裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(n

10、=10)，2.5μmol/L OTA處理組(n=10)，陽(yáng)性對(duì)照BGC-823組(n=3)，4-6周齡雄性BALB/C-nu裸鼠，分別將100μl1×108/ml的細(xì)胞懸液皮下注射于裸鼠右側(cè)腋窩區(qū)，16周后處死小鼠。3成瘤標(biāo)本檢測(cè):取出皮下腫瘤，HE染色結(jié)果證實(shí)為接種瘤，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示為上皮來(lái)源。同時(shí)，提取裸鼠腫瘤組織總RNA和總蛋白，進(jìn)行Western Blot和Real time PCR檢測(cè)上皮標(biāo)志物cytokeratin

11、的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1 OTA長(zhǎng)期染毒GES-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組GES-1細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，排列有序，形態(tài)為梭形，細(xì)胞核圓形其邊界清晰，細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)清晰。2.5μmol/L OTA染毒40代后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞鏡下呈多角形，大小不一，細(xì)胞間排列緊密，可見多核巨細(xì)胞，并呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，排列紊亂，很多細(xì)胞周邊多呈毛刺狀。
　　2 OTA對(duì)GES-1細(xì)胞遷移力的影響
　　采

12、用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察OTA對(duì)GES-1細(xì)胞遷移力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2.5μmol/L OTA染毒組在第10代與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第20代時(shí)開始出現(xiàn)遷移速度增高，第30代細(xì)胞朝向劃痕遷移的速度明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，至第40代細(xì)胞遷移速度明顯增高，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。此外，采用Transwell方法觀察了OTA對(duì)GES-1細(xì)胞侵襲能力的影響，于接種后72小時(shí)計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目并拍照記錄。2.5μmol/L OTA染

13、毒組在第40代時(shí)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目427±12.02明顯高于對(duì)照組103±7.96，差異顯著(P＜0.05)。
　　3 OTA對(duì)GES-1細(xì)胞獨(dú)立錨著生長(zhǎng)能力的影響
　　采用軟瓊脂克隆試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞獨(dú)立錨著生長(zhǎng)能力，2.5μmol/L OTA染毒20代時(shí)細(xì)胞在軟瓊脂上可形成小的細(xì)胞集落，細(xì)胞以數(shù)十個(gè)左右聚集成團(tuán)，但生長(zhǎng)緩慢，不能進(jìn)一步形成較大的克隆，達(dá)不到每個(gè)集落大于50個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn);至第30代時(shí)，2.5μmol/L OTA染毒

14、組細(xì)胞能在軟瓊脂上形成克隆并可見光滑輪廓的集落形成，但接種裸鼠并沒有成瘤;至第40代時(shí)，2.5μmol/L OTA染毒組細(xì)胞形成的克隆數(shù)目多并且大，接種裸鼠可見皮下腫瘤形成。
　　4裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
　　分別收集2.5μmol/L OTA染毒40代細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照組胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞，將1×107個(gè)不同組別的細(xì)胞皮下注射于每只裸鼠右側(cè)腋窩區(qū)，接種后3周時(shí)2.5μmol/L OTA染毒組10只中有6只接種部位出

15、現(xiàn)可見的腫塊，接種后16周時(shí)瘤塊的直徑達(dá)1.52-1.61cm左右，陽(yáng)性對(duì)照組接種后1周全部出現(xiàn)腫瘤，接種后16周時(shí)瘤塊的直徑達(dá)1.94-2.35cm左右。與此同時(shí)，裸鼠體內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)其他瘤塊，對(duì)照組小鼠皮下及體內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤生成。
　　5裸鼠成瘤組織的病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)觀察
　　接種瘤組織行福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片，切片進(jìn)行HE染色和免疫組化檢查，HE染色觀察2.5μmol/L OTA處理組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞形成的皮

16、下腫瘤組織無(wú)差異，均可見高分裂像，瘤細(xì)胞排列密集形狀近于卵圓形或多邊形。免疫組化顯示，上皮來(lái)源標(biāo)志蛋白cytokeratin呈陽(yáng)性表達(dá)。提取接種瘤組織的蛋白和RNA進(jìn)行Western Blot和Real time PCR檢測(cè)上皮標(biāo)志物cytokeratin，結(jié)果顯示cytokeratin呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。
　　綜上結(jié)果說(shuō)明2.5μmol/L OTA染毒20代時(shí)遷移侵襲能力增強(qiáng)，克隆形成，可能是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的早期關(guān)鍵階段;OTA染毒

17、30代時(shí)可見光滑輪廓的集落形成，但接種裸鼠并沒有成瘤;至第40代時(shí)，形成的克隆數(shù)目多并且大，接種裸鼠可見皮下腫瘤形成;證明2.5μmol/L OTA慢性染毒40代時(shí)誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步證實(shí)了OTA對(duì)人類細(xì)胞的致癌性。
　　第二部分 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在赭曲霉毒素A長(zhǎng)期染毒誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用
　　目的:探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在赭曲霉毒素A誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性

18、轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。
　　方法:
　　1分組及處理:實(shí)驗(yàn)分為OTA處理組和對(duì)照組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞，用10％ DMEM接種于培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至40-50％時(shí)，給予2.5μmol/L OTA處理72h，一周一次，分別取染毒10代，20代，30代和40代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)2.5μM OTA染毒組和對(duì)照組細(xì)胞E-cadherin/β-catenin復(fù)合物表達(dá)情況。3利用激光共聚焦技術(shù)觀察β-cate

19、nin的核移位情況。4利用Western blot以及real-time PCR觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路中相關(guān)分子(Dvl、GSK3β、Wnt2、β-catenin、Tcf4、Lef1)的蛋白及mRNA表達(dá)情況。5采用Western Blot和Real time PCR方法檢測(cè)β-catenin siRNA干擾對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子的影響。6給予Wnt信號(hào)通路的抑制劑DKK-1

20、，選用OTA染毒40代細(xì)胞，給予50nM預(yù)處理1h，觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路中分子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1 OTA長(zhǎng)期染毒誘導(dǎo)GES-1惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中E-cadherin/β-catenin復(fù)合物形成情況
　　β-catenin最初是作為與細(xì)胞膜上鈣依賴性粘附分子E-cadherin相互作用的胞內(nèi)分子得以分離和克隆的，β-catenin通過(guò)與E-cacdherin形成復(fù)合物的功能主要是，參與細(xì)胞的

21、粘附、遷徙與轉(zhuǎn)移。采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)E-cadherin/β-catenin復(fù)合物形成，與對(duì)照組相比，2.5μM OTA染毒30代時(shí)復(fù)合物形成降低，染毒40代時(shí)復(fù)合物形成明顯降低(P＜0.05)。說(shuō)明在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞膜上的β-catenin表達(dá)水平降低。
　　2 OTA長(zhǎng)期染毒誘導(dǎo)GES-1惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中β-catenin的核移位情況
　　β-catenin不僅是細(xì)胞粘附分子，還是Wnt信號(hào)通路中重要的傳遞子。β-c

22、atenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位是Wnt信號(hào)通路活化的重要標(biāo)志事件。通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)于2.5μM OTA染毒20代時(shí)β-catenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，染毒30代時(shí)核轉(zhuǎn)位較對(duì)照組明顯增加，染毒40代時(shí)與對(duì)照組比較，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活在OTA長(zhǎng)期染毒誘導(dǎo)GES-1惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中作用
　　在證明OTA處理能夠?qū)е娄?catenin核轉(zhuǎn)位的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Real

23、-time PCR檢測(cè)了OTA處理不同時(shí)間GES-1細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要成員wnt2、β-catenin、 GSK3β、Dvl、Tcf4和Lef1在mRNA水平上表達(dá)情況，結(jié)果顯示，2.5μmol/L OTA染毒20代前，上述Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)與對(duì)照組沒有明顯差異，OTA染毒30代時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)較對(duì)照組出現(xiàn)差異，當(dāng)OTA染毒40代時(shí)Wnt/β-c

24、atenin信號(hào)通路中分子Wnt2、β-catenin、Tcf4、Lef1 mRNA的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，而Dvl和GSK3β mRNA的表達(dá)水平明顯則明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，2.5μM OTA染毒30代時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中具有活性的磷酸化的p-Dvl和p-GSK3β蛋白表達(dá)水平增加，OTA染毒40代時(shí)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子(Wnt2、β-catenin、

25、Tcf4、Lef1)蛋白表達(dá)較對(duì)照組具有顯著差異(P＜0.05)，而失活的Dvl，GSK3β蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。
　　表明OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活。
　　進(jìn)一步證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路在OTA誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。
　　4 siRNA干擾對(duì)GES-1細(xì)胞Wnt通路的影響
　　β-catenin siRNA以及C

26、ontrol siRNA轉(zhuǎn)染OTA處理40代細(xì)胞48小時(shí)后收集細(xì)胞。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示:β-catenin siRNA可以顯著降低GES-1細(xì)胞β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明，β-catenin siRNA序列可以明顯干擾β-catenin在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)選擇該siRNA序列進(jìn)行研究。
　　Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與C

27、ontrol siRNA+2.5μM OTA處理組相比，β-catenin siRNA+2.5μM OTA處理組轉(zhuǎn)錄因子Tcf4和Lef1的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。同時(shí)檢測(cè)Wnt通路的靶基因CyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)較對(duì)照組亦明顯降低(P＜0.05)，提示β-catenin siRNA干擾可以阻斷OTA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)OTA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
　　綜上結(jié)

28、果表明，長(zhǎng)期OTA染毒引起GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中Wnt信號(hào)通路活化，促進(jìn)TCF核轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),從而使細(xì)胞獲得惡性增殖的能力。
　　5 DKK-1預(yù)處理在GES-1細(xì)胞Wnt/β-catenin通路激活中的作用
　　以上研究結(jié)果表明，OTA染毒40代時(shí)Wntβ-catenin信號(hào)通路激活，通過(guò)給予Wnt通路特異抑制劑DKK-1預(yù)處理從正反兩方面驗(yàn)證Wnt信號(hào)通路的活化。Western Blot結(jié)果顯示，2.5

29、μM OTA染毒40代時(shí)，給予Wnt特異性抑制劑DKK-1預(yù)處理后Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵分子Wnt2、β-catenin、Tcf4、Lef1的蛋白表達(dá)水平較單獨(dú)OTA處理組明顯下降(P＜0.05)。表明DKK-1可以阻斷OTA誘導(dǎo)的Wnt通路激活。
　　進(jìn)一步阻斷證明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活參與了OTA引起GES-1細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。
　　第三部分氧化應(yīng)激在OTA長(zhǎng)期染毒誘導(dǎo)的胃黏膜上

30、皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其機(jī)制
　　目的:揭示OTA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及分子機(jī)制。
　　方法:
　　1分組及處理:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞，分為對(duì)照組，OTA處理組和抗氧化組，用10％ DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×104個(gè)/L，接種于培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別給予2.5μmol/L OTA處理72h，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)4mM預(yù)處理1 h+2.5μmol/L OT

31、A處理72h，一周一次，染毒直至40代。2對(duì)照組，2.5μmol/L OTA處理組，NAC+2.5μmol/L OTA處理組細(xì)胞子染毒10代，20代，30代和40代時(shí)采用熒光探針DCFH-DA和DHE檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化。2采用超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測(cè)試盒檢測(cè)OTA染毒10代，20代，30代和40代時(shí)細(xì)胞SOD活性及MDA含量的變化。3觀察2.5μmol/L OTA處理組，NAC+2.5μmol/L OTA處理

32、組細(xì)胞在染毒30和40代時(shí)克隆形成情況，裸鼠成瘤情況。2采用Western Blot和Real-time PCR方法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1 OTA長(zhǎng)期染毒誘導(dǎo)GES-1惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中ROS水平的變化
　　OTA的毒性和致癌性已經(jīng)證實(shí)與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，2.5μM OTA染毒20代前DCF、 DHE平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有變化但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，O

33、TA染毒30代DCF、DHE平均熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);為了進(jìn)一步明確OTA通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)采用抗氧化劑NAC預(yù)處理來(lái)減少ROS。OTA染毒40代，抗氧化劑NAC+2.5μmol/L OTA處理組與單獨(dú)OTA處理組相比，DCF、DHE平均熒光強(qiáng)度明顯減低（P＜0.05）。結(jié)果顯示，OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞ROS生成增多，NAC緩解了OTA促ROS升高作用。
　　2 OTA對(duì)GES-1細(xì)胞

34、SOD活性和MDA含量的影響
　　SOD活性檢測(cè)結(jié)果表明，2.5μMOTA染毒30代時(shí)SOD活性為30.58±2.59 U/mg protein，顯著低于對(duì)照組119.11±7.55U/mg protein(P＜0.05); NAC+OTA處理組SOD活性較單獨(dú)OTA處理組明顯升高（66.68±5.61 vs30.58±2.59 U/mg protein，P＜0.05）。與對(duì)照組比較，OTA處理組MDA含量顯著升高(P＜0.05)

35、，NAC+OTA處理組較單獨(dú)OTA處理組明顯降低(P＜0.05，F(xiàn)ig.2B)。說(shuō)明OTA可以引起GES-1細(xì)胞明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。
　　3 NAC預(yù)處理對(duì)OTA長(zhǎng)期染毒GES-1細(xì)胞獨(dú)立錨著生長(zhǎng)能力的影響
　　軟瓊脂克隆試驗(yàn)證明，OTA染毒30代時(shí)2.5μmol/L OTA組細(xì)胞能在軟瓊脂上形成克隆，NAC+2.5μmol/L OTA處理組與2.5μmol/L OTA處理組相比，形成的集落明顯減少，OTA染毒40代時(shí)，與

36、2.5μmol/L OTA處理組比較，NAC+2.5μmol/L OTA處理組形成的克隆數(shù)目及光滑輪廓的集落形成減小。
　　4 NAC預(yù)處理對(duì)OTA誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的影響
　　分別收集2.5μmol/L OTA染毒40代細(xì)胞，NAC+2.5μmol/L OTA染毒40代細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞，將1×107個(gè)不同組別的細(xì)胞皮下注射于每只裸鼠右側(cè)腋窩區(qū)，接種后3周時(shí)OTA處理組10只中有6只接種部位可見皮下瘤塊，接種后5周

37、時(shí)NAC+ OTA處理組10只中有3只接種部位出現(xiàn)瘤塊，接種后16周時(shí)OTA處理組瘤塊的直徑達(dá)1.52-1.61cm左右，NAC+ OTA處理組瘤塊的直徑在0.58-0.67cm左右。
　　5 NAC預(yù)處理對(duì)OTA誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響
　　大量研究顯示致癌物的致癌機(jī)制之一就是氧化應(yīng)激介導(dǎo)的Wnt信號(hào)通路的激活。Western Blot方法顯示,2.5μmol/L OTA處理組相比，NAC

38、+OTA染毒40代時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子的水平明顯降低(P均＜0.05)。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與2.5μmol/L OTA染毒相比，NAC+染毒組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。
　　6 DKK-1預(yù)處理在OTA引起氧化應(yīng)激介導(dǎo)的GES-1細(xì)胞Wnt通路激活中的作用
　　Western Blot結(jié)果顯示，NAC+OTA染毒40代時(shí)，給予Wnt信號(hào)通路特異性抑制劑DKK-1預(yù)處理后

39、Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵分子Wnt2、β-catenin、P-Gsk3β的蛋白表達(dá)水平較單獨(dú)OTA處理組明顯下降(P＜0.05)。表明DKK-1可以阻斷氧化應(yīng)激介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活。
　　綜上結(jié)果表明，應(yīng)激介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化進(jìn)而參與OTA慢性染毒誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論:
　　1 OTA慢性染毒能夠誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，細(xì)胞遷

40、移、侵襲和克隆形成能力增強(qiáng)，并可致裸鼠成瘤。
　　2 OTA慢性染毒能夠誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。
　　3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)胞獲得惡性增殖的能力。
　　4氧化應(yīng)激參與了OTA慢性染毒誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。
　　5給予氧化應(yīng)激拮抗劑NAC可以降低OTA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化作用。
　　6氧