赭曲霉毒素A單鏈抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是飼料和食品中污染較多、分布較廣的真菌毒素之一。近年來，對赭曲霉毒素A檢測方法的研究正不斷深入。高效液相色譜法和免疫學(xué)檢測法是目前赭曲霉毒素A的常用檢測方法。與高效液相法相比，免疫學(xué)檢測法具有經(jīng)濟(jì)、快速、操作簡便等優(yōu)勢，靈敏度相當(dāng)或更高，對檢測樣品的純度要求不高，因而特別適用于大批量樣品的檢測。傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測法主要通過多克隆抗體或單克隆抗體構(gòu)建，由于多克隆抗體的成分復(fù)雜，制備成本高昂且質(zhì)量

2、不穩(wěn)定，單克隆抗體雖特異性強(qiáng)，多樣性卻較差，因而使免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展受到了限制。相比之下，單鏈抗體具有相對分子量小、組織穿透力強(qiáng)、特異性強(qiáng)、表達(dá)形式多樣、表達(dá)量大且生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，近年來的研究正日益增多。本研究以赭曲霉毒素A為對象開展實(shí)驗(yàn)，從免疫小鼠的脾細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增出抗體可變區(qū)的全套基因，通過基因工程技術(shù)，獲得OTA單鏈抗體，并初步建立了飼料中OTA毒素的免疫學(xué)檢測方法，為構(gòu)建檢測試劑盒提供參考和依據(jù)。
　　試驗(yàn)Ⅰ赭曲霉毒素A

3、偶聯(lián)抗原的制備采用活性酯法合成OTA-KLH偶聯(lián)抗原作為免疫抗原，碳二亞胺法合成OTA-OVA偶聯(lián)抗原作為包被抗原;采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和紫外掃描法對偶聯(lián)抗原進(jìn)行分析;采用間接ELISA方法檢測OTA-OVA偶聯(lián)抗原的反應(yīng)原性;OTA-KLH偶聯(lián)抗原免疫小鼠以檢測其免疫原性。結(jié)果顯示，考馬斯亮藍(lán)法測得OTA-KLH濃度為6.6139g·L-1，OTA-OVA濃度為2.3543g·L-1;兩種抗原均偶聯(lián)成功，但K

4、LH蛋白由于分子量較大，SDS-PAGE并不適用于該偶聯(lián)物偶聯(lián)效果的分析;OTA-KLH的偶聯(lián)比為14∶1，OTA-OVA的偶聯(lián)比為9∶1;間接ELISA結(jié)果顯示，OTA-OVA偶聯(lián)抗原具有良好的反應(yīng)原性;小鼠免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OTA-KLH偶聯(lián)抗原具有較高的免疫原性，血清效價檢測結(jié)果說明，免疫小鼠的脾臟滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。
　　試驗(yàn)Ⅱ赭曲霉毒素A單鏈抗體的制備提取小鼠脾細(xì)胞總RNA，RT-PCR合成cDNA第一條鏈，設(shè)計(jì)合適的引

5、物分別擴(kuò)增出OTA單鏈抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，經(jīng)過三個步驟合成以VL-Linker-VH形式相連的ScFv片段;將ScFv片段插入pCANTAB5E載體，導(dǎo)入大腸桿菌TG1中，以O(shè)TA-OVA偶聯(lián)抗原作為包被抗原，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行免疫親和篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的陽性菌株;提取陽性菌株的質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌HB2151中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得OTA單鏈抗體。結(jié)果顯示，從小鼠脾細(xì)胞的基因組擴(kuò)增出的VH和VL片段大

6、小分別約為350bp和325bp左右，最終合成的ScFv片段大小約為750bp左右;利用噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)過五輪篩選，獲得三株特異性分泌單鏈抗體的陽性菌株;對陽性菌質(zhì)粒進(jìn)行分析，最終確定ScFv基因核苷酸序列大小約為720～726bp左右，共編碼242個氨基酸，重鏈約354～370bp，編碼118～123個氨基酸，輕鏈約321～330bp，編碼107～110個氨基酸;在HB2151中，OTA單鏈抗體最終以可溶性表達(dá)產(chǎn)物的形式表達(dá)于細(xì)胞周

7、間質(zhì)中，親和純化后，經(jīng)WesternBlot鑒定具有抗原特異性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　試驗(yàn)Ⅲ赭曲霉毒素A單鏈抗體的初步應(yīng)用圍繞本實(shí)驗(yàn)所制備的OTA單鏈抗體進(jìn)行研究，采用間接非競爭ELISA法鑒定其親和力，并確定偶聯(lián)抗原最佳包被濃度及單鏈抗體最佳工作濃度;采用間接競爭ELISA法檢測其靈敏度，計(jì)算檢出限和50％抑制濃度(IC50);對單鏈抗體與赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、黃曲霉毒素B1、伏馬菌素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒

8、素以及OVA蛋白的交叉反應(yīng)性進(jìn)行檢測;分別采用間接競爭ELISA法和高效液相法測定樣品的加標(biāo)回收率，對比評價OTA單鏈抗體構(gòu)建間接競爭ELISA檢測方法的可行性;最后對隨機(jī)采集的市售樣品分別采用間接競爭ELISA法和高效液相法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所制備的OTA單鏈抗體親和常數(shù)為（2.21±0.31）×107L·mol-1，檢出限為0.055ng·mL-1，IC50為1.125ng·mL-1;該方法的準(zhǔn)確性較高，組內(nèi)和組間平均變異系