赭曲霉毒素A納米抗體的免疫學(xué)檢測性能及分子作用機(jī)理研究.pdf

1、赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）是一種由青霉素屬和曲霉屬的某些菌種產(chǎn)生的真菌毒素，主要污染谷物及其制品，具有神經(jīng)毒性、肝腎毒性等多種毒性作用。建立谷物中OTA污染殘留的有效監(jiān)控和檢測方法是防止其造成食品安全問題的重要手段。目前，OTA的檢測方法主要包括高校液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、免疫學(xué)分析法等，其中免疫學(xué)分析法具有快速、靈敏等特點(diǎn)，適合大批量樣本的篩查。納米抗體（Nanobody,Nb）是目前已知的最小抗原結(jié)合單

2、位，源自駝源動(dòng)物體內(nèi)重鏈抗體的重鏈可變區(qū)，具有易表達(dá)、水溶性好、穩(wěn)定性高等性質(zhì)，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、疾病治療、食品安全分析等領(lǐng)域。本研究制備了抗OTA Nb，并對其檢測性能和作用機(jī)理進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：
　　1、OTA Nb噬菌體展示文庫的構(gòu)建、淘選及應(yīng)用
　　1.1 成功構(gòu)建了一個(gè)庫容為2×107cfu且多樣性良好的OTA Nb初始文庫，經(jīng)輔助噬菌體救援后獲得滴度為4×1012cfu/mL的抗OTA Nb噬

3、菌體展示文庫，結(jié)合Gly-HCl洗脫和標(biāo)準(zhǔn)品競爭洗脫兩種方式，進(jìn)行四輪親和淘選，經(jīng)鑒定及DNA測序分析，共獲得4種獨(dú)特的Nb序列。
　　1.2 建立了基于噬菌體VHH-28超靈敏檢測谷物中OTA的噬菌體RT-IPCR，LOD為3.7 fg/mL，線性范圍0.01-1000pg/mL，與OTB的交叉反應(yīng)率為3.5％，OTA加標(biāo)回收率80-126%，實(shí)際谷物樣本的RT-IPCR檢測結(jié)果與商業(yè)OTA ELISA試劑盒的檢測結(jié)果相關(guān)性良好

4、。
　　2、OTA Nb的原核表達(dá)、活性分析及應(yīng)用
　　2.1 成功制備了四種OTA納米抗體Nb15、28、32、36，間接競爭ELISA測得IC50分別為160.34、0.64、17.60、286.15ng/mL。四種Nb的熱穩(wěn)定性良好，95℃加熱5min和90℃加熱60min后保留了至少50%和25%的抗原結(jié)合能力。采用Bio-layer interferometry生物傳感器測定了Nb的平衡解離常數(shù)，同時(shí)采用同源建模和

5、分子對接技術(shù)研究了Nb與OTA的相互作用機(jī)理，結(jié)果表明Nb與OTA之間的相互作用力主要包括氫鍵和疏水作用，且親和力與靈敏度呈正相關(guān)性。
　　2.2 建立了基于Nb28檢測谷物中OTA的Nb-ELISA，IC500.64ng/mL，線性范圍0.27-1.47ng/mL，LOD0.16ng/mL，與OTB的交叉反應(yīng)率為10.4%，批內(nèi)加標(biāo)回收率81-108%，批內(nèi)變異系數(shù)1-9%，批間加標(biāo)回收率為85-99%，批間變異系數(shù)為5-6%。

6、實(shí)際谷物樣本的Nb-ELISA檢測結(jié)果與商業(yè)OTA ELISA試劑盒的檢測結(jié)果相關(guān)性良好。
　　3、OTA Nb-AP融合蛋白的原核表達(dá)、活性分析及應(yīng)用
　　成功構(gòu)制備了Nb28-AP融合蛋白，該融合蛋白仍保留良好的抗原結(jié)合能力和堿性磷酸酶活性。以Nb28-AP融合蛋白為檢測探針，建立了檢測谷物中OTA的dc-FEIA，IC500.13 ng/mL，線性范圍0.06-0.43ng/mL，LOD0.04ng/mL。與其它常見真