抗黃曲霉毒素B1納米抗體的免疫學(xué)性能分析及其體外定點改造.pdf

1、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是—種主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于花生、玉米、小麥等農(nóng)作物中，通過食品和飼料途徑使人畜中毒。AFB1具有強(qiáng)致癌、致畸、致毒性等作用，同時還可降低細(xì)胞免疫力。鑒于AFB1的巨大危害，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)建立了多種檢測方法。其中，基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析方法，具有簡便快速、特異性好、適合高通量檢測等特點，從而被廣泛應(yīng)用。高質(zhì)量抗體的制備是建立特異性強(qiáng)、靈敏

2、度高的免疫分析方法的關(guān)鍵。納米抗體（Nanobody，Nb）是目前已知的最小抗原結(jié)合片段，具有易表達(dá)、水溶性好、穩(wěn)定性高等性質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于食品安全分析、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域。同時，為提高酶聯(lián)免疫吸附法（ Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的靈敏度，最直接的辦法可通過基因改造，制備高親和力的抗體來實現(xiàn)。本研究制備了抗AFB1納米抗體，并對其進(jìn)行定向改造，主要研究內(nèi)容如下：
　　1.抗AFB1

3、納米抗體的淘選、表達(dá)及活性分析
　　以人工抗原AFB1-OVA為靶分子，進(jìn)行四輪固相親和淘選（1輪酸洗脫+3輪競爭洗脫），從噬菌體展示的納米抗體免疫文庫中淘選得到16種獨特的抗AFB1納米抗體序列，其中克隆pHEN1-G8的阻斷效果最佳，其半數(shù)抑制濃度（Inhibitory Concentration，IC50）值為0.98 ng/mL。將pHEN1-G8的基因克隆至載體pET25b(+)構(gòu)建重組載體pET25b(+)-G8，轉(zhuǎn)入

4、E.coli Rosetta(DE3)表達(dá)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并鎳柱純化，獲得分子量約為20 KDa的納米抗體Nb-G8。間接競爭ELISA測得其IC50為4.61 ng/mL，線性范圍1.14 ng/mL~18.59 ng/mL。
　　2. pET25b(+)-G8-AP融合蛋白的原核表達(dá)、純化及活性分析
　　將編碼堿性磷酸酶（ Alkaline Phosphatase， AP）的基因克隆至表達(dá)載體pET25b(+)-

5、G8中，構(gòu)建融合表達(dá)載體 pET25b(+)-G8-AP，并在 E.coli BL21(Rosetta，DE3）中進(jìn)行原核表達(dá)。經(jīng)ELISA分析，純化后的融合蛋白G8-AP同時具有良好的抗原結(jié)合能力和堿性磷酸酶活性。G8-AP的堿性磷酸酶比活力為364.51±8.34 U/mg。融合蛋白G8-AP的IC50為5.25 ng/mL，線性范圍1.02~26.98 ng/mL。與其它常見真菌毒素未見明顯交叉反應(yīng)，批內(nèi)變異系數(shù)低于10％。

6、>　　3.納米抗體Nb-G8的分子模擬及丙氨酸掃描
　　同源建模構(gòu)建Nb-G8的3-D結(jié)構(gòu)模型，采用分子對接技術(shù)構(gòu)建Nb-G8與AFB1的結(jié)合模型，預(yù)測了多個抗原抗體關(guān)鍵氨基酸結(jié)合熱點。采用丙氨酸掃描技術(shù)初步對預(yù)測的6個關(guān)鍵氨基酸加以驗證。6個關(guān)鍵氨基酸突變?yōu)楸彼岷螅琓32A的生物活性與G8（Wild type，WT）相比，未見明顯差異；而突變子I33A、F49A、W54A和V112A的靈敏度下降，突變子Y106A完全喪失抗原結(jié)