花生黃曲霉毒素B1單鏈抗體的研制及其檢測(cè).pdf

1、黃曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的一種毒素，國(guó)際上以黃曲霉毒素的毒性作為10，000的基準(zhǔn)，來(lái)比較其它物質(zhì)的毒性。黃曲霉毒素的危害性主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈的毒性和致癌性，由于它在花生、玉米等食品中廣泛存在，因此嚴(yán)重危害了人們的身體健康。在現(xiàn)代社會(huì)里，隨著人們生活水平的提高，人們?nèi)找骊P(guān)注食品安全問題。食品安全已引起各國(guó)政府的嚴(yán)重關(guān)注，歐盟在2000年就提出了世界上最嚴(yán)格的安全標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，其中AFB1為2

2、μg/kg，總黃曲霉毒素為4μg/kg。因此，也形成了新貿(mào)易壁壘，對(duì)我們國(guó)家的農(nóng)產(chǎn)品出口造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。 本試驗(yàn)從AFB1-BSA免疫小白鼠開始，先使用間接ELISA評(píng)價(jià)免疫后抗血清的效價(jià)，然后選擇抗血清最高效價(jià)達(dá)到了64，000的小鼠，提取小鼠的脾臟的總RNA，根據(jù)他們對(duì)應(yīng)的引物，通過RT-PCR分別擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的重鏈VH、輕鏈VL和連接多肽Linker的基因，然后通過引物設(shè)計(jì)成重疊延伸拼接(splicingbyoverl

3、apextension，SOE)PCR方法擴(kuò)增出單鏈抗體scFv基因。把scFv基因與Pharmcia公司提供的質(zhì)粒載體pCANTAB-5E連接起來(lái)，通過電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，就構(gòu)建了庫(kù)容量達(dá)到了108單鏈抗體抗體庫(kù)。 單鏈抗體抗體庫(kù)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，通過輔助噬菌體M13KO7進(jìn)行超感染后，單鏈抗體就展示噬菌體衣殼蛋白的N端，從而得到噬菌體抗體庫(kù)。這樣的噬菌體抗體庫(kù)可以通過三輪“淘洗—富集—擴(kuò)增”以后，通過ELISA檢測(cè)從而獲

4、得針對(duì)AFB1-BSA具有特異性抗性的抗體。再把這種噬菌體抗體庫(kù)的上清感染HB2151，使得單鏈抗體在大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá)后，通過ELISA檢測(cè)分泌到菌液和細(xì)胞周質(zhì)腔中的單鏈抗體蛋白的相對(duì)活性。我們?cè)囼?yàn)的結(jié)果是獲得了三可以分泌特異性抗體的菌株，它們分別是3C3、3B3和4A2。 由于單鏈抗體主要在疾病治療中應(yīng)用更為廣泛一點(diǎn)，由于它本身的遺傳穩(wěn)定性并不好，因此，單鏈抗體很少直接應(yīng)用檢測(cè)。因此在試驗(yàn)最后，我們直接購(gòu)買江蘇微生物所