膠體金層析技術(shù)快速檢測中藥中赭曲霉毒素A研究.pdf

1、膠體金標記技術(shù)是繼熒光素標記、放射性同位素標記和酶標記三大重要標記技術(shù)后的又一重要標記技術(shù)，已在生物醫(yī)學(xué)、藥物殘留、激素檢測、危險品檢測、毒品快速檢測、臨床診斷、離子檢測、食品安全檢測等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。膠體金層析技術(shù)是膠體金標記技術(shù)與層析技術(shù)良好結(jié)合的新技術(shù)，按照與膠體金顆粒相結(jié)合物質(zhì)類別的差異，可分為膠體金免疫層析法和膠體金適配子層析法。
　　赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉菌屬和青霉菌屬等產(chǎn)生的有毒

2、代謝產(chǎn)物，對人和動物的生命健康危害極大，有很強的腎毒性及致癌、致畸和免疫抑制作用等，有研究指出，它主要通過促進膜的過氧化，抑制線粒體呼吸作用亦或是影響細胞信號傳導(dǎo)過程中蛋白和其他關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)錄表達等過程從而產(chǎn)生致毒效應(yīng)，已被國際癌癥組織(IARC)定義為人類可能的致癌物（2B級）。中藥材作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的精華，使用歷史悠久。然而，中藥同糧食、谷物等眾多農(nóng)作物一樣，種植、生長、采收、加工、炮制以及儲存等過程中，均可能受曲霉菌屬和青霉菌屬等

3、真菌污染進而產(chǎn)生赭曲霉毒素A，很有必要建立靈敏準確的中藥中OTA快速檢測技術(shù)?；诖?，本論文建立了中藥中OTA的膠體金層析快速檢測技術(shù)，并采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對新技術(shù)檢測結(jié)果進行確證。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　(1)建立了膠體金免疫層析方法快速檢測赭曲霉毒素A(OTA)。
　　采用Frens法制備合適粒徑的膠體金溶液，并用紫外分光光度計在400-800nm進行全波長掃描，計算膠體金顆粒粒徑，透射電鏡下觀察顆粒表觀，形狀以及大

4、小等。反復(fù)試驗，最終確定及穩(wěn)定所需粒徑的膠體金溶液燒制方法?？疾炷z體金標記抗體最低穩(wěn)定量以及膠體金標記抗體最適pH，同時篩選檢測線、控制線溶液濃度以及耗材型號等，選擇最佳條件制備試紙條。進行試紙條性能考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所制備試紙條穩(wěn)定，可長期保存，對OTA的檢測靈敏度為5 ng/mL，且特異性良好，不與其他真菌毒素發(fā)生交叉反應(yīng)。
　　(2)建立了膠體金適配子層析方法快速檢測赭曲霉毒素A(OTA)。
　　制備合適粒徑的膠體金溶液

5、，考察膠體金標記適配子最低穩(wěn)定量，注意考察優(yōu)化最佳偶聯(lián)條件，同時篩選檢測線、控制線溶液濃度以及耗材型號等，選擇最佳條件制備試紙條。進行試紙條性能考察，其靈敏度為5 ng/mL，并且特異性良好，不與其他真菌毒素發(fā)生交叉反應(yīng)。且相較膠體金免疫層析試紙條，成本明顯降低。試紙條檢測試驗可重復(fù)，且長期保持穩(wěn)定。
　　(3)建立了檢測中藥中OTA的UFLC-MS/MS方法，并對膠體金免疫層析試紙條和膠體金適配子層析試紙條的檢測結(jié)果進行驗證。<

6、br>　　樣品經(jīng)80％的甲醇（水）溶液提取，以水（含0.1％甲酸）/乙腈（含0.1％甲酸）為流動相，采用梯度洗脫的方法進行液相色譜分離，在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下，1.0-40.0 ng/mL范圍內(nèi)，OTA的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9993。 OTA高中低三個添加水平的回收率在78.83％～91.74％之間，相對標準偏差在1.39％～6.24％之間。該方法簡單快速、靈敏度高和選擇性好，適用于中藥中真菌毒素OTA的檢測。采用所建立的UFL