基于適體識(shí)別技術(shù)檢測(cè)中藥中赭曲霉毒素A.pdf

1、適體是近幾年來(lái)通過(guò)指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)體外篩選得到的一類與目標(biāo)分子高親和力、高特異性結(jié)合的寡聚核苷酸片段。作為一個(gè)優(yōu)于抗體的新型識(shí)別分子，適體已在食品快速檢驗(yàn)、環(huán)境檢測(cè)、新藥研發(fā)、臨床診斷和治療以及毒理研究等領(lǐng)域展示了良好的應(yīng)用前景。但在真毒毒素領(lǐng)域的應(yīng)用剛剛起步，特別是中藥材等復(fù)雜基質(zhì)中的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外還處于空白。赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉菌（Aspergillus）屬和青霉菌（Penicillium）屬等菌株代謝

2、產(chǎn)生，具有強(qiáng)烈的腎毒性，致癌、致畸、致突變等作用。研究表明，OTA不僅廣泛污染于農(nóng)作物及食品中，近年來(lái)甘草、香辛料等中草藥中也被證實(shí)廣泛存在。因此，鑒于OTA普遍性和危害性，應(yīng)該建立有效的快速檢測(cè)方法，以控制中藥中OTA的污染，為制定合理的限量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。傳統(tǒng)的基于免疫親和柱凈化的檢測(cè)技術(shù)不能達(dá)到快速篩查，簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的目的。本文基于適體識(shí)別技術(shù)自制了適體親和柱，首次用于中藥中OTA的凈化。同時(shí)借助于先進(jìn)的分析技術(shù)，建立了多種中藥中OT

3、A的快速檢測(cè)方法，AAC用于中藥等復(fù)雜基質(zhì)凈化的方法特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、快速，經(jīng)濟(jì)，可用于大量樣品的快速篩查。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:
　　(1)篩選了特異性吸附OTA的適體DNA序列，優(yōu)選了偶聯(lián)方式，首次制備了OTA適體親和柱(AAC)，并對(duì)制備的AAC性能進(jìn)行了考察。
　　根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，合成了不同真菌毒素適體DNA序列，考察了它們吸附OTA的特異性，結(jié)果顯示，Apt-1(5'-NH2-(CH2)6-GAT CGG GTG

4、 TGG GTG GCG TAAAGG GAG CAT CGG ACA-3')為OTA特異性適體DNA序列;采用NHS-activatedsephaorse4FF為載體，室溫?fù)u床微微震搖反應(yīng)3h為共價(jià)偶聯(lián)條件;AAC最大吸附量達(dá)到188.96±10.56 ng。說(shuō)明該制備方法特異性強(qiáng)、吸附量大、批間差異小、簡(jiǎn)單、快速、條件溫和。
　　(2)首次建立了AAC凈化超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)姜粉中OTA及質(zhì)譜確證，并隨機(jī)對(duì)市場(chǎng)上姜粉

5、樣品的污染狀況進(jìn)行了調(diào)查。
　　姜粉樣品經(jīng)乙腈-水（60∶40，v/v）混合溶劑提取，通過(guò)AAC凈化，用超高效液相色譜-熒光檢測(cè)器(UPLC-FLR)進(jìn)行快速檢測(cè)，并以UFLC-MS/MS對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證。該法檢測(cè)限為0.5μg/kg，在5-45μg/kg添加水平下，回收率范圍在81.40-98.36％之間，RSD為2.18-4.26％，在25批樣品中，13批樣品為陽(yáng)性，污染水平在1.51-4.31μg/kg之間，方法的準(zhǔn)確性和

6、IAC具有很好的相關(guān)性，而AAC重復(fù)利用性是IAC的兩倍。該方法簡(jiǎn)單、快速(OTA保留時(shí)間＜4 min)準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，可用于大量樣品的快速篩查。
　　(3)首次建立了渦旋輔助固相微提取-適體親和柱凈化-超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)中藥中OTA，并考察了AAC柱在中藥中的適用性及其基質(zhì)效應(yīng)。
　　樣品經(jīng)乙腈-水(60∶40，v/v)混合溶劑渦旋輔助微提取后，通過(guò)AAC凈化，采用UFC-MS/MS法快速定性、定量測(cè)定。m/z

7、404.2→358.0和m/z404.2→239.1分別為OTA定性和定量離子對(duì)，ESI+為質(zhì)譜離子源，掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)-信息關(guān)聯(lián)采集-增強(qiáng)型子離子掃描的組合掃描方式（MRM-IDA-EPI），以O(shè)TA和內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮峰面積的比值對(duì)OTA的濃度作線性回歸，線性范圍0.2-20 ng/mL，不同基質(zhì)中的檢測(cè)限在0.5-0.8μg/kg之間，在4-100μg/kg添加水平下，回收率為80.26-96.64％，RSD低于6.0％。在篩選的6