T-2毒素與黃曲霉毒素特異性抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、T-2毒素和黃曲霉毒素均是由真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，在自然界中分布廣泛，成為花生、玉米、大豆、大米等農(nóng)作物的主要污染物，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量及其質(zhì)量。它們不僅能夠?qū)θ?、畜產(chǎn)生免疫毒性、細(xì)胞毒性，而且還有較強(qiáng)的致癌作用，其中黃曲霉毒素被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)致癌物質(zhì)之一?；谡婢舅貙?duì)人畜的危害，很多國家對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的含量都制定了限量標(biāo)準(zhǔn)，并將此作為貿(mào)易壁壘的手段之一。隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，人們對(duì)日益突出的食品安全問題看得越

2、來越重，要求也越來越高，食品安全問題更關(guān)系到社會(huì)穩(wěn)定與和諧。如何突破國際貿(mào)易壁壘，減少經(jīng)濟(jì)損失，讓人們吃上安全放心的食品成為亟待解決的問題，而研究建立真菌毒素的免疫分析技術(shù)是解決這一問題的重要手段。
　　抗體是免疫分析技術(shù)的核心，抗體的特異性和靈敏度直接決定著免疫分析技術(shù)的好壞。以往的免疫分析檢測技術(shù)大都是基于單克隆抗體和多克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞能夠在體外無限繁殖，只要細(xì)胞株不發(fā)生基因突變，就可以通過培養(yǎng)無限的生產(chǎn)高特異性、高均一性

3、的單克隆抗體抗體，但是目前已報(bào)道的T-2單克隆抗體的靈敏度不夠高、特異性不強(qiáng)，還不能滿足檢測需求，因此研制更高靈敏度的T-2單克隆抗體勢在必行。
　　近年來，納米抗體逐漸走進(jìn)人們的視野，它以耐有機(jī)溶劑、耐高溫、耐酸堿性等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受人們期待，基于納米抗體的檢測技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，開創(chuàng)一個(gè)全新的研究領(lǐng)域。隨著對(duì)納米抗體的需求量的增加，如何實(shí)現(xiàn)納米抗體的批量生產(chǎn)必將成為納米抗體技術(shù)發(fā)展中至關(guān)重要的一環(huán)。
　　針對(duì)上述問題，本研究的

4、內(nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　1.研制出高靈敏度的抗T-2毒素的單克隆抗體。首先將T-2毒素與琥珀酸通過琥珀酸酐法反應(yīng)生成T-2HS，再通過活潑酯法，將T-2毒素半抗原分別與牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)共價(jià)偶聯(lián)，合成出T-2毒素人工抗原T-2HS-BSA和T2HS-OVA，以T-2HS-BSA作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與相應(yīng)比例的小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，采用半固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并通過兩步篩選法進(jìn)行篩選分

5、泌抗T2毒素抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用間接競爭法檢測單克隆抗體的特異性，共獲得4株性能良好的單克隆細(xì)胞株，分別是1D6、2A8、2C5和4G3。其中2C5所分泌抗體的靈敏度(IC50)為0.13ng/mL，分泌抗體的性能穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，與HT2的交叉反應(yīng)率為4％，與FB1、DON、ZEN無交叉反應(yīng)。與已有報(bào)道相比，2C5是目前最好的抗體。
　　2.利用2C5抗體研究建立了間接競爭ELISA檢測方法，最低檢測限為0.015ng/mL，檢

6、測范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.05～57.6 ng/mL，該方法對(duì)大豆、玉米、花生等糧油產(chǎn)品的檢測范圍為0.5576μ g/kg，在線性范圍內(nèi)加標(biāo)回收率為93.5％～107.5％，本研究建立的檢測方法可用于大豆、玉米、花生等多種糧油產(chǎn)品中T-2毒素的檢測。
　　3.研究建立了黃曲霉毒素B1納米抗體批量制備技術(shù)。利用本實(shí)驗(yàn)室已獲得的菌株，通過對(duì)納米抗體表達(dá)的最適誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度等條件的優(yōu)化，探明最佳誘導(dǎo)溫度為33℃

7、，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10h，最佳誘導(dǎo)劑濃度為1mmol/L。建立了基于發(fā)酵罐的納米抗體批量生產(chǎn)技術(shù)。批量生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1的納米抗體靈敏度(IC50)為0.75ng/mL，特異性良好，這與何婷微量制備的納米抗體相比，抗體主要技術(shù)參數(shù)基本保持一致，而抗體的產(chǎn)量得到了大大提高。
　　4.研制出納米抗體免疫親和柱。利用制備的納米抗體，通過參照傳統(tǒng)親和柱的制備方法，研制出了新型的免疫親和柱，親和柱的柱容量為200ng，通過與傳統(tǒng)免疫親和柱的