食品中黃曲霉毒素測(cè)定

1、3 食品中黃曲霉毒素測(cè)定  黃曲霉毒素是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，目前已分離鑒定出12種，包括B1、B2、Gl、G2、Ml、M2、Pl、Q、H1、GM、B2。和毒醇。黃曲霉毒素的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?。即含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)。前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)。M1是黃曲霉毒素B1在體內(nèi)經(jīng)過(guò)羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素的主要分子型式含B1、

2、B2、G1、G2、M1、M2等。其中M1和M2主要存在于牛奶中。B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。在紫外線下，黃曲霉毒素B1、B2發(fā)藍(lán)色熒光，黃曲霉毒素G1、G2發(fā)綠色熒光。黃曲霉毒素的相對(duì)分子量為312～346。難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中較穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解。 在pH9—10的強(qiáng)酸溶液中分解迅速。其純品為無(wú)色結(jié)晶，耐高溫，黃曲霉毒素B1的分

3、解溫度為268℃紫外線對(duì)低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性。,1,感謝你的欣賞,2019-8-14,3.1．薄層層析法 薄層層析是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù)。自1990年，它被列為AOAC(association of official agricultural chemists)標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法同時(shí)具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能。 3.1.1 原理 本法是利用樣品中的黃曲霉毒素B1，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、

4、凈化、濃縮、薄層分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來(lái)測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量。 薄層色譜法黃曲霉毒素Bt的最低檢出量為0．000 4ug，最低檢出濃度為5ug／Kg。。,2,感謝你的欣賞,2019-8-14,3.1.2 儀器和試劑 (1)儀器 小型粉碎機(jī)、樣篩、電動(dòng)振蕩器、玻璃濃縮器、玻璃板5cm×20cm、薄層板涂布器、展開(kāi)槽(25cm×6cm&

5、#215;4cm)、紫外光燈100一125w、波長(zhǎng)365nm濾光片、微量注射器(2)試劑 ①三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、無(wú)水乙醚或乙醚經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水、丙酮。以上試劑在試驗(yàn)前需先進(jìn)行空白試驗(yàn)，如不干擾測(cè)定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。 ②硅膠G(薄層色譜用)、三氟乙酸、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。 ③黃曲霉毒素B1

6、標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取1～1．2mg AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此標(biāo)準(zhǔn)液濃度約為10ug／mL。先用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，再用苯一乙腈混合液調(diào)整其濃度為準(zhǔn)確10．0ug／mL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩爾消光系數(shù)為19 800 .,3,感謝你的欣賞,2019-8-14,④黃曲霉毒素B：標(biāo)準(zhǔn)使用液： I液(1.0ug／mL)：取1mL AFT

7、B標(biāo)準(zhǔn)液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀釋、定容。 Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。。 ⑤次氯酸鈉溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，攪拌均勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3·H2O)溶于500mL溫水中。將兩液合并、攪拌、澄清、過(guò)濾。此液含次氯酸25g／L。污染的

8、玻璃器皿用次氯酸鈉溶液浸泡可達(dá)到去毒的效果。,4,感謝你的欣賞,2019-8-14,3.1.3操作步驟 (1)樣品處理 樣品從大樣經(jīng)粗碎及連續(xù)多次用四分法縮減至0．5～lkg后全部粉碎。糧食樣品全部通過(guò)20目篩，花生樣品全部通過(guò)10目篩、混勻。 (2)提取 稱取20.00g經(jīng)粉碎樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液，瓶塞上涂一層水、蓋嚴(yán)防漏

9、。振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過(guò)濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶?jī)?nèi)。取20.00mL甲醇水溶液(相當(dāng)于4.0g樣品)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振搖2min、靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷濕潤(rùn)的無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙，過(guò)濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲

10、烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過(guò)濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜，于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后于冰盒上冷卻2～3min后，準(zhǔn)確加入1mL苯一乙腈混合液。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌希粲斜降慕Y(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL的具塞試管中。,5,感謝你的欣賞,2019-8-14,(3)測(cè)定 ①單向展開(kāi)法 a．薄板制備：稱取3g硅膠G，加

11、2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊狀后，倒人涂布器推成5cm×20cm，厚度約0.25mm的薄層板3塊。在空氣中干燥15min，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，可再活化后使用。 b．點(diǎn)樣：將薄板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血紅素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距為lcm，點(diǎn)直徑約3mm，在同一板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加

12、時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吸邊加。滴加樣式如下： 第一點(diǎn)：10μL AFTB，標(biāo)準(zhǔn)使用液(0．04μg／mL)。 第二點(diǎn)：20μL樣液。第三點(diǎn)：20μL樣液+10μL 0.04μg／mL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點(diǎn)：20μL樣液+10μL 0.02tLg，／m L AFTB。標(biāo)準(zhǔn)使用液。 ②展開(kāi)與觀察 在展開(kāi)槽內(nèi)加10mL無(wú)水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開(kāi)槽內(nèi)加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展開(kāi)1

13、0～12cm，取出，在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下：,6,感謝你的欣賞,2019-8-14,a．由于樣液上加滴了AFTB1標(biāo)準(zhǔn)，可使AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中AFTB1熒光點(diǎn)重疊。若樣液為陰性，薄板上第三點(diǎn)AFTB1為0．000 4μg，可用作檢查樣液中AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；若樣液為陽(yáng)性；則起定性作用。薄層板上第四點(diǎn)AFTB1標(biāo)準(zhǔn)為0．002ug．主要起定位作用。 b．若第二點(diǎn)與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無(wú)藍(lán)色熒光點(diǎn)，

14、則表示樣品中AFTBl含量<5ug／kg；若在相應(yīng)位置上有藍(lán)色熒光點(diǎn)，則須進(jìn)行確證試驗(yàn)。 ③確證試驗(yàn) 為確認(rèn)薄層樣上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開(kāi)后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。 第一點(diǎn)：10uL 0．04ug／mL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20／μL樣液于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min(

15、板上溫度不高于40℃)，再于薄層板上滴加以下兩點(diǎn)。 第三點(diǎn)：10uL 0.04ug／mL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點(diǎn)：20μL樣液。,7,感謝你的欣賞,2019-8-14,按上法展開(kāi)并觀察，樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。 ④稀釋定量：樣液中的AFTB1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，如與AFTB1。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)最低檢出量(0.00 04μg)的熒光強(qiáng)度一致，則樣品中

16、AFTB1含量為即為5~g／kg． 若樣液中熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)，減少滴加微升數(shù)，或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。滴加式樣如下： 第一點(diǎn)：l0uL AFTB1，標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.04ug／mL)。 第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10uL樣液。 第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15uL樣液。 第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20uL樣液。,8,感謝你的欣賞,2019

17、-8-14,4)結(jié)果計(jì)算 X = 式中：X 一 樣品中AFTBl的含量，ug／kg； V1一加入苯一乙腈混合液的體積，mL； V2—出現(xiàn)最低熒光時(shí)滴加樣液的體積，mL； D一樣液的總稀釋倍數(shù)； m1—加入苯一乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)樣品的質(zhì)量，g；0.0004—AFTBl的最低檢出限量，ug。,9,感謝你的欣賞,2019-8-14,3.2．雙向展開(kāi)法 3.

18、2.1 原理 如用單向展開(kāi)法后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了AFTB1的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開(kāi)法。薄層板先用無(wú)水乙醚做橫向展開(kāi)，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊，而AFTB1不動(dòng)，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做縱向展開(kāi)，樣品在相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法的靈敏度。 3.2.2操作步驟 (1)點(diǎn)樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上，在距左邊緣0．8～1cm第二篇食品理化檢測(cè)技術(shù)處，各滴加10uL AFTB

19、1(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液，在距左邊緣2.8～3cm處，各滴加20uL樣液。然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上滴加l0uL AFTBl(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液，在第三塊板的樣液點(diǎn)上滴加10uL AFTB1(0.02ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液。,10,感謝你的欣賞,2019-8-14,(2)展開(kāi)： a．橫向展開(kāi)：在展開(kāi)槽內(nèi)的長(zhǎng)邊置一玻璃支架，加10mL無(wú)水乙醇，將上述點(diǎn)好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊，置于展開(kāi)槽內(nèi)展開(kāi)，展至板端后，取出揮干。根據(jù)情

20、況，需要時(shí)，可再重復(fù)l～2次。 b．縱向展開(kāi)：揮干的薄層板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展開(kāi)至10～12cm為止。丙酮與氯甲烷的比例，根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。 (3)觀察與評(píng)定結(jié)果： a．在紫外光下觀察第一、二塊板，若第二塊板在AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而在第一板與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光，則樣品中AFTBl含量<5ug／kg.,11,感謝你的欣賞,2019-8-14,b．若第一塊板與第二塊板

21、的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一塊板與第三塊板比較，這第三塊板上第二點(diǎn)與第一塊板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。在具體測(cè)定中，三塊板可以同時(shí)做，也可按順序做。當(dāng)?shù)谝粔K板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三塊板可以省略，如第一塊板為陽(yáng)性，則第二塊板可省略，直接做第三塊。 (4)確認(rèn)試驗(yàn)：另取薄層板二塊，于第四、五兩板距左邊緣0.8～1cm處，各滴加10u LATTB1(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液及

22、一小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3cm處，于第四板滴加20uL樣液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL樣液、10uL。AFTBl(0.04ug／mL)標(biāo)準(zhǔn)液及一小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用熱風(fēng)吹2min(板上溫度不高于40℃)。再用雙向展開(kāi)法展開(kāi)后，觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。若樣液AFTB1含量較高時(shí)，則將樣液稀釋后，按單向展開(kāi)法中(4)做確認(rèn)試驗(yàn) .,12,感謝你

23、的欣賞,2019-8-14,13,感謝你的欣賞,2019-8-14,(5)稀釋定量： 若樣液中AFTBl含量較高，可按單向展開(kāi)法中(5)稀釋定量操作。若AFTB1含量較低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開(kāi)板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果判斷，可將樣液再做雙向展開(kāi)法測(cè)定，以確定含量。 3.2.3 結(jié)果計(jì)算 同單向展開(kāi)法。 3.2.4 說(shuō)明及注意事項(xiàng) 用過(guò)后受污染的玻璃器皿，應(yīng)經(jīng)次氯酸溶液(25g／