抗黃曲霉毒素G-,1-單克隆抗體的制備與特性鑒定.pdf

1、本研究通過(guò)制備AFG1人工免疫抗原,免疫Balb/c小鼠獲得了特異性較高的多克隆抗體；進(jìn)一步將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,制得雜交瘤細(xì)胞,通過(guò)HAT培養(yǎng)基篩選,獲得三株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；對(duì)三株細(xì)胞腹水單克隆抗體的特性進(jìn)行鑒定,均具有較強(qiáng)的特異性,為酶聯(lián)免疫和免疫親和技術(shù)檢測(cè)黃曲霉毒素G1分量及總量奠定了基礎(chǔ)。主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 1、建立了黃曲霉毒素G1人工抗原合成方法。分別采用肟化法和環(huán)氧化物法兩種方法將AFG1與BS

2、A進(jìn)行偶聯(lián),制備人工抗原。通過(guò)TLC、紫外掃描、熒光強(qiáng)度變化以及小鼠抗血清的制備等方法確證兩相體系環(huán)氧化物法成功合成了AFG1-BSA偶聯(lián)物,產(chǎn)物中AFG1與BSA的摩爾比最大為4.29:1,且小鼠免疫效果良好,最高效價(jià)可達(dá)16000。 2、優(yōu)化了融合細(xì)胞的培養(yǎng)方法,改善了雜交瘤細(xì)胞的存活率。通過(guò)對(duì)不同批次胎牛血清、不同來(lái)源SP2/0細(xì)胞、傳統(tǒng)液體培養(yǎng)與自制半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行比較,以及生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇的添加,擺脫了對(duì)飼養(yǎng)

3、細(xì)胞的依賴,優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)條件。結(jié)果表明,胎牛血清070831、實(shí)體瘤SP2/0、生長(zhǎng)因子添加物HFCS以及β-巰基乙醇的使用能夠較好的提高細(xì)胞融合率和陽(yáng)性率,而半固體培養(yǎng)基的采用則有效的縮短了培養(yǎng)周期,利于陽(yáng)性細(xì)胞的存活。 3、采用優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行新融合細(xì)胞的培養(yǎng),間接非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA初篩和間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA終篩相結(jié)合,最終從672株細(xì)胞中得到了3株能穩(wěn)定分泌抗黃曲霉毒素G1抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1C8、1C

4、10和DE7。對(duì)它們的特性作了初步鑒定,經(jīng)ELISA鑒定3株單克隆抗體均為IgG2a。對(duì)單克隆雜交瘤的染色體計(jì)數(shù)結(jié)果是三株均在102-108條之間。在單抗的SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)中,1C8、1C10和DE7重鏈的分子量均為50 KD左右,輕鏈分子量為25 KD左右。用ELISA檢測(cè)腹水上清的效價(jià),1C8、1C10和DE7三株單抗的腹水效價(jià)可達(dá)1:104-105。三株單抗1C8、1C10和DE7對(duì)AFG1的親和力大小分別為5.07×10