水禽IgY單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、采集麻鴨、鵝、斑頭雁和鸕鶿等水禽血清,以辛酸-硫酸銨法提取水禽IgY,利用Hiload16/60 superdex200 prep pg凝膠柱,以500μL上樣量、0.3mL/min流速對粗提水禽IgY進行純化,收集不同洗脫峰進行SDS-PAGE電泳分析,對其重鏈進行質譜鑒定,經MALDI-TOF/TOF‘圖譜分析,并進行蛋白質數(shù)據(jù)庫檢索。結果顯示,水禽血清的辛酸-硫酸銨提取物主要含3種不同蛋白組分,鴨血清辛酸-硫酸銨提取物主要由IgM

2、、完整型IgY和缺失型IgY(△Fc)組成。
　　 用純化的麻鴨、鵝、斑頭雁和鸕鶿等水禽血清IgY抗原按不同免疫方式組合免疫6-8周齡BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0在聚乙二醇作用下進行細胞融合,以HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)后,經間接ELISA篩選和有限稀釋法克隆化,獲得14株穩(wěn)定分泌抗鴨IgY單克隆抗體的細胞株,分別命名為:1B6、2C3、2A5、2C10、2E12、2G12、3A8、3F4、4G6、4G1

3、2、5C4、5F4、5H9、6F5;獲得5株穩(wěn)定分泌抗鵝IgY單克隆抗體的細胞株,分別命名為:2F7、5D8、6A2、6C1、6D11;獲得10株穩(wěn)定分泌抗斑頭雁IgY單克隆抗體的細胞株,分別命名為:1H7、1F1、2A12、2D6、3F1、3G1、4B1、4E4、5D4、7D3;獲得5株穩(wěn)定分泌抗鸕鶿IgY單克隆抗體的細胞株,分別命名為:1G2、4C7、5F12、6G12、7E3。將雜交瘤細胞注入經降殖烷致敏的BALB/c小鼠誘生腹水

4、,獲得水禽IgY單克隆抗體。
　　 利用間接ELISA和Western-blotting對水禽IgY單克隆抗體的特異性、腹水效價、對不同水禽IgY的交叉反應性等進行鑒定,篩選出7株能識別15種水禽(麻鴨、鵝、鸕鶿、斑頭雁、番鴨、夜鷺、白鷺、遺鷗、斑尾塍鷸、中杓鷸、鴻雁、綠翅鴨、花臉鴨、赤頸鴨、斑嘴鴨)IgY的共同抗原表位單克隆抗體:3A8、5F4、5H9、5D4、7D3、6A2和6D11,其中3A8、5F4、5H9、5D4識別I

5、gY輕鏈,7D3、6A2、6D11識別IgY重鏈。同時,鑒定了水禽的種特異性單克隆抗體,1B6特異識別番鴨IgY輕鏈,4G12特異識別麻鴨和斑嘴鴨IgY輕鏈;3G1和3F1特異識別鵝及雁類IgY,其中3G1識別IgY輕鏈,3F1識別IgY重鏈:1G2、4C7和6G12特異識別鸕鶿IgY輕鏈,5F12和7E3特異識別鸕鶿IgY及白鷺I(yè)gY輕鏈。此外,2A5、2A12、3A8、3F4、481、4E4、5C4、5D4、5F4、5H9、6A2、