羊促乳素單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、促乳素(prolactin，PRL)為腺垂體促乳素細胞分泌的肽類激素，在人類和動物生殖中主要生理作用為促進乳腺發(fā)育、啟動泌乳和維持泌乳。在家畜，尤其是在羊的繁殖生產中，產后生理性的高促乳素水平會抑制卵巢功能，表現(xiàn)為卵巢上無卵泡發(fā)育和排卵，而使母羊產后哺乳期間不能配種妊娠，從而使羊的產羔間隔延長。在肉羊生產中，提高養(yǎng)殖效益的最有效的途徑之一就是盡可能地縮短母羊產羔間隔。而縮短產羔間隔最有效的措施，就是在早期斷奶和改善母羊營養(yǎng)狀況等措施的基

2、礎上，盡快降低母羊促乳素水平、恢復卵巢活動。已有研究者采用溴隱亭有效降低促乳素水平，促進母羊卵巢功能的恢復和發(fā)情?？焖俳档湍秆蝮w內促乳素分泌的另一條途徑就是使用促乳素多克隆或單克隆抗體。 利用羊促乳素純品和Freund佐劑作為免疫原，采用常規(guī)的免疫程序，間接ELISA檢測結果顯示，分別在第1天，15天和29天免疫三次后，血清抗體效價1:8 000～1:10 000之間，表明抗原的免疫原性很好，第四次加強免疫后3 d，脾細胞可用于

3、細胞融合。 為了篩選分泌抗體的陽性雜交瘤細胞，以促乳素免疫過的BALB/C小鼠血清為陽性對照，以未免疫的BALB/C小鼠血清為陰性對照，通過對ELISA檢測條件的優(yōu)化，建立了檢測羊促乳素抗體的間接ELISA檢測方法，其主要條件如下：pH9.6，0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(CBS)為包被液，0.1μg/mL的抗原為包被抗原，1％BSA為封閉液，1:200為血清的最佳稀釋倍數(shù)，1:10 000.為酶標二抗最佳工作濃度，90

4、 min為酶標二抗作用時間，30 min為底物作用時間。試驗證明本法特異性強，有較好的重復性。用該法對促乳素免疫小鼠的血清抗體及其雜交瘤細胞單抗上清進行檢測。 以1mL40％聚乙二醇4 000(PEG 4 000)為融合劑，選用對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按照1:5-1:10的比例在室溫下進行融合，整個融合過程控制在1min，盡量保持勻速，然后在3 min內用基礎培養(yǎng)液8 mL稀釋PEG，速度為先慢后快，使其失去

5、促融作用，離心，洗滌后，融合后的細胞用HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，融合后每3 d～4 d半量換液一次，在融合后第3天出現(xiàn)小的克隆，第7天雜交瘤細胞鋪滿孔底50％，用建立的間接ELISA法篩選陽性孔，克隆率為69％，陽性克隆率為23％。 陽性培養(yǎng)孔篩選結束后，采用有限稀釋法篩選陽性克隆，通過誘生腹水法制備單克隆抗體，并用核型分析對雜交瘤細胞的染色體進行初步鑒定。通過細胞融合，獲得五株能穩(wěn)定分泌抗促乳素特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命