單克隆抗體的制備實(shí)驗(yàn)

1、單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn),Caspar Gu,2019-4-12,目錄,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)材料,實(shí)驗(yàn)步驟,注意事項(xiàng),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解并掌握單克隆抗體的制備原理； 熟悉單克隆抗體的制備過(guò)程；熟練掌握無(wú)菌操作技術(shù)。,二、實(shí)驗(yàn)原理,三、實(shí)驗(yàn)材料,超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。,剪刀、鑷子、解剖板、平皿（直徑為10cm），15ml/50ml一次性

2、離心管，50ml玻璃融合管200目不銹鋼細(xì)胞篩，玻璃注射器針芯，10ml玻璃注射器（9號(hào)針頭）,融合前一周復(fù)蘇，第二天換液，長(zhǎng)滿后傳代，融合前一天換液。一次融合需2~3瓶（75m2）Sp2/0細(xì)胞。,四、實(shí)驗(yàn)步驟(1),1. 取飼養(yǎng)細(xì)胞取一只SPF級(jí)6-8周齡ICR小鼠，斷頸處死，置75%乙醇中消毒5min↓取一只10ml玻璃注射器，吸入7~8ml含10%FBS、HAT的RPMI1640培養(yǎng)基，剪開(kāi)皮膚、沿切口上下撕開(kāi)皮膚，充分暴

3、露腹部，換鑷子，拎起腹膜，沿腹部中線偏左下方進(jìn)針，針頭不要進(jìn)入內(nèi)臟器官，取一個(gè)干凈的酒精棉球輕輕擠壓小鼠腹部，同時(shí)反復(fù)吹打注射器，反復(fù)3-5次，待培養(yǎng)基變黃后將其轉(zhuǎn)移到80mlHAT培養(yǎng)基中，備用。,2. 取免疫小鼠脾臟免疫小鼠摘眼球取血后斷頸處死，置75%乙醇中消毒5min↓將高壓過(guò)的細(xì)胞曬放到平皿中，細(xì)胞曬中加入10ml左右的無(wú)血清1640，小鼠左側(cè)臥位，剪開(kāi)皮膚，沿切口上下撕開(kāi)皮膚，可以看到脾臟所在位置；換剪刀、鑷子，剪開(kāi)腹

4、膜，充分暴露脾臟；換剪刀、鑷子，鑷子輕輕夾住脾臟，用剪刀分離脾臟，盡量不要帶結(jié)締組織，將脾臟放入鋼網(wǎng)中，用無(wú)菌的針頭戳幾下，用玻璃針芯輕輕擠壓脾臟直至僅剩包膜，用幾毫升無(wú)血清1640沖洗針芯和細(xì)胞曬，將濾液置于50ml離心管中，備用。,3. 收集Sp2/0細(xì)胞  取已長(zhǎng)滿的Sp2/0細(xì)胞2~3瓶，用彎頭尖吸管將細(xì)胞吹下來(lái)，置于50ml離心管中，原瓶補(bǔ)液繼續(xù)培養(yǎng)↓4. 清洗脾細(xì)胞和Sp2/0 細(xì)胞 800rpm

5、，離心5min↓棄上清，輕輕磕幾下50ml離心管底部（使細(xì)胞團(tuán)塊松散），加入兩吸管無(wú)血清1640，輕輕吹打均勻，補(bǔ)培養(yǎng)液至20ml↓脾細(xì)胞和Sp2/0 細(xì)胞，800rpm，離心5min↓5. 融合         將PEG1500置于37℃水浴鍋上，熔化后，加入0.5ml無(wú)血清1640，混勻，即為50%PEG↓取離心好的脾細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞，棄上清（注意保持

6、這個(gè)姿勢(shì)）用濾紙條輕輕沾去管壁上的培養(yǎng)液（保證PEG不被稀釋）。將離心管放到37℃水浴中（用一小燒杯制備水?。?min加入PEG（邊加邊攪），攪30sec；靜止1min。,四、實(shí)驗(yàn)步驟(2),四、實(shí)驗(yàn)步驟(3),6. 終止    將一吸管無(wú)血清培養(yǎng)液在1min內(nèi)加入細(xì)胞中，動(dòng)作盡量輕柔，邊加邊攪。（此時(shí)，細(xì)胞在PEG作用下已變形皺縮，加液太快，動(dòng)作過(guò)粗，會(huì)引起細(xì)胞破裂死亡。）隨后，不用計(jì)時(shí)，但仍要慢慢滴加培養(yǎng)液，

7、最后補(bǔ)液至20ml?！?00rpm，離心5min↓7. 鋪板   棄上清，細(xì)胞團(tuán)塊溶于100ml HAT培養(yǎng)液（前面已經(jīng)準(zhǔn)備好的）內(nèi)，充分混勻后，鋪板5-7塊。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱,第二天檢查是否污染，第五天計(jì)算融合率，第七天換液（一定要沿孔壁把原孔液體吸干凈），第十天檢測(cè)。,五 . 注意事項(xiàng),1 .無(wú)菌操作：?jiǎn)慰寺】贵w的制備過(guò)程需要嚴(yán)格無(wú)菌，包括使用的器械、試劑等均需要無(wú)菌處理， 注意實(shí)驗(yàn)操作中的