抗創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是一種有莢膜的革蘭陰性嗜鹽弧菌,主要生長(zhǎng)于海水中、魚類及貝母類等體內(nèi)<'[1]>.本菌感染主要引起原發(fā)性敗血癥<'[2]>和嚴(yán)重的創(chuàng)口感染.其中原發(fā)性敗血癥起病急驟,病程進(jìn)展迅速,致死率高于50﹪,通常在發(fā)病后1-2周內(nèi)死亡<'[3]>.該病的確診需從病人的血液及創(chuàng)口分泌物中檢出創(chuàng)傷弧菌,給臨床快速診斷和治療帶來(lái)很大的困難. 關(guān)于創(chuàng)傷弧菌致病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素<'[

2、4]>(VVC)是創(chuàng)傷弧菌重要的致病因子.VVC是由創(chuàng)傷弧菌結(jié)構(gòu)基因vvhA編碼的一種相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為50 851Da的蛋白質(zhì),是創(chuàng)傷弧菌唯一釋放至胞外的細(xì)胞毒素,在創(chuàng)傷弧菌致病中起著重要作用. 本研究用利用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌抗創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,對(duì)雜交瘤細(xì)胞及其單克隆抗體分析鑒定,為進(jìn)一步研制創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ). 實(shí)驗(yàn)方法: 1.表達(dá)載體中目的基因的序列分析.

3、2.重組蛋白的表達(dá)及純化pET32a(+)-vvhA經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白;超聲裂解細(xì)菌提取蛋白質(zhì),通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)量;以HisTag單克隆抗體為一抗Western Blot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性;以Ni-NTA親和層析法收集表達(dá)的帶His.lag的目的蛋白. 3.單克隆抗體的制備將經(jīng)純化的目的蛋白免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)H

4、AT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng),用間接ELISA法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞篩選.抗體陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)連續(xù)3次克隆后,建立穩(wěn)定分泌抗創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株. 4.雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體的鑒定用雙向瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定單克隆抗體的Ig類別和亞類.細(xì)胞連續(xù)傳代三個(gè)月及液氮凍存一個(gè)月后復(fù)蘇,不同時(shí)間取其培養(yǎng)液上清,用間接ELISA法檢測(cè)其抗體效價(jià),測(cè)定抗體分泌的穩(wěn)定性. 采用ELISA法將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌超聲破碎

5、抗原分別與所得單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng),對(duì)單克隆抗體的特異性進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)用雙向瓊脂擴(kuò)散法予以驗(yàn)證. 結(jié)果：1.表達(dá)載體中目的基因的序列分析表達(dá)載體中目的基因的測(cè)序結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的序列比較,所克隆的vvhA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為96.09﹪和98.26﹪,同源性比較時(shí)不包括引物序列. 2.重組蛋白的表達(dá)及純化0.5mmol/1 IPTG在28℃3h以上能很好地誘導(dǎo)rVVC的表達(dá),其表達(dá)量高達(dá)細(xì)菌總蛋白30﹪左右;'

6、Western BlotZ結(jié)果顯示與His.Tag單克隆抗體良好的免疫反應(yīng)性;經(jīng)超聲處理后Ni-NTA親和層析法純化,純度達(dá)90﹪以上. 3.單克隆抗體的制備對(duì)連續(xù)3次克隆的雜交瘤細(xì)胞用間接ELISA方法進(jìn)行篩選,建立了2株(C2D6和E6F3)穩(wěn)定分泌抗創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株. 4.雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體的鑒定雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代三個(gè)月,分泌抗體的能力穩(wěn)定;液氮凍存一個(gè)月后復(fù)蘇,對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè),抗體

7、仍為陽(yáng)性.經(jīng)免疫雙擴(kuò)散法測(cè)定,C2D6和E6F3株分泌的抗rVVC單克隆抗體類型均為IgGl型. 純化的C2D6和E6F3單克隆抗體與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌超聲破碎抗原用ELISA法及免疫雙擴(kuò)法檢測(cè),結(jié)果均為陰性. 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)用Ni-NTA親和層析法純化所得蛋白作為抗原免疫BAI,B/c小鼠,利用雜交瘤技術(shù),共獲得了2株穩(wěn)定分泌特異性、高效價(jià)抗創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株