抗牛γ-干擾素單克隆抗體制備和鑒定.pdf

1、γ-干擾素（IFN-γ）主要是在特定的抗原、有絲分裂原（ConA、PHA）的刺激下由活化T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性的糖蛋白。自Cerretti于1986年首次克隆出乳牛IFN-γ基因后，重組牛IFN-γ（rBoIFN-γ）先后在原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)、巴斯德畢赤氏酵母系統(tǒng)、牛I型皰疹病毒載體（BHV-1）中成功獲得了表達(dá)，并對(duì)其免疫學(xué)和生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。國(guó)內(nèi)外關(guān)于牛IFN

2、-γ的研究和應(yīng)用方面的工作已經(jīng)開展很多，但不論是對(duì)免疫細(xì)胞功能及機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答方面的研究，還是對(duì)疾病狀態(tài)下IFN-γ產(chǎn)生水平的判定，都需要一種簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)手段。應(yīng)用牛IFN-γ單克隆抗體作為研究、檢測(cè)IFN-γ的手段，在免疫機(jī)制的研究、免疫功能檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
　　 本研究通過(guò)常規(guī)PCR方法從pMD18-T-BoIFN-γ質(zhì)粒中擴(kuò)增出BoIFN-γ成熟蛋白基因，并將其插入原核表達(dá)載體pET30a和pGEX-6p-

3、1中，經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)后，分別轉(zhuǎn)化入Rosetta（DE3）pLysS中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)分別表達(dá)出約18ku和42ku左右的融合蛋白。以純化的rHis-BoIFN-γ蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，用純化的rGST-BoIFN-γ蛋白做為檢測(cè)抗原，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，通過(guò)間接ELISA方法進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選，共篩選出4株穩(wěn)定分泌抗rBoIFN-γ的單克隆抗體的細(xì)胞株，分別命名為3C9、3D10、2C12、5C4，免疫球蛋

4、白類均為IgM，輕鏈為κ鏈；雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)傳代15次以上及凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，效價(jià)穩(wěn)定；腹水效價(jià)分別為1:51200、1:51200、1:12800、1:6400。Western blot結(jié)果表明，4株單抗均可特異性的識(shí)別rGST-BoIFN-γ蛋白，而不與GST標(biāo)簽蛋白反應(yīng)。間接ELISA試驗(yàn)證明，4株單抗只與rBoIFN-γ反應(yīng)，而不與GST蛋白和rGoIFN-α、rGoIFN-γ、rBoIFN-α等細(xì)胞因子發(fā)生交叉反應(yīng)