鼠抗人CD52單克隆抗體制備.pdf

1、人類CD52抗原屬于一個只有十二個氨基酸殘基（GQNDTSQTSSPS）的GPI錨定糖蛋白，N末端在3位天冬酰氨上連接有一個具有負電荷唾液酸殘基的復(fù)雜的糖基，C末端通過與GPI錨連接而使整個分子固定在細胞膜上。CD52抗原廣泛分布于淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞等造血細胞上以及雄性生殖上皮細胞表面。CD52在細胞上表達密度高，就淋巴細胞而言每個淋巴細胞上約有450000個分子，約占到細胞表面成分的5％，因此成為了抗體攻擊的理想的靶抗原

2、。在1980年劍橋大學(xué)就發(fā)現(xiàn)了CD52抗體能在體外通過加入人的補體后殺傷帶有CD52抗原的靶細胞。因此尋找到有殺傷抑制作用的CD52抗體具有重要的應(yīng)用價值。至今最成功的抗CD52抗體藥物是Alemtuzumab（campath-1H），是一個經(jīng)過人源化改造的抗CD52單克隆抗體，被成功用于一些慢性淋巴細胞白血病和自身免疫疾病的治療和研究。
　　 本課題主要是采用雜交瘤技術(shù)制備功能性的抗人CD52單克隆抗體，同時建立穩(wěn)定CD52真

3、核轉(zhuǎn)染細胞系，以便于快速準(zhǔn)確篩選抗人CD52單克隆抗體。實驗方法如下：
　　 首先，應(yīng)用HUT-78細胞提取細胞總RNA，運用RT-PCR方法擴增CD52基因，定向克隆入真核表達載體pcDNA3.1（+），用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞系，用RT-PCR、FACS、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞系中目的基因和蛋白的表達。
　　 其次，根據(jù)NCBI提供的CD52抗原的結(jié)構(gòu)特點及campath-1H作用

4、的抗原表位特點，設(shè)計合成了靠近CD52抗原C基末端的八個氨基酸的短肽，用于免疫和篩選抗人CD52單克隆抗體。
　　 最后，采用合成肽CD52-KLH免疫Balb/c鼠，進行細胞融合與培養(yǎng)，用合成肽CD52-BSA進行間接ELISA實驗初步篩選，通過FACS和Western blot鑒定抗體，MTS實驗篩選鑒定有細胞抑制作用的抗體。
　　 結(jié)果顯示建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞系，初步篩選鑒定出兩株抗人CD52單克隆抗體，為進