抗人CD13單克隆抗體的研制.pdf

1、實驗目的：通過基因免疫的方法研制抗人髓細胞表面分子CD13單克隆抗體。 實驗方法：1)RT-PCR克隆人CD13分子酶活性域(第69～480位氨基酸)基因，將此基因插入真核表達載體pcDNA3.1(+)，構建重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)/CD13。2)用基因免疫的方法，將重組質粒pcDNA3.1(+)/CD13通過肌肉注射免疫BALB/C小鼠，經兩次常規(guī)免疫后，經尾靜脈注射高表達CD13的髓細胞白血病細胞系HL60進行

2、加強免疫。3)用常規(guī)免疫學技術，取基因免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系NS1融合，初步篩選出穩(wěn)定大量分泌抗人CD13單克隆抗體的雜交瘤細胞株。4)使用各種高表達或不表達CD13的細胞系、正常人外周血細胞和10例白血病患者骨髓樣本，通過間接免疫熒光流式細胞術、熒光顯微鏡檢測以及WesternBlot實驗，對單抗進一步的鑒定，獲得特異性和臨床符合率最好的雜交瘤細胞株2E3。5)經免疫球蛋白類別檢測試劑盒檢測抗人CD13單抗類別。6)對2E3進

3、行小鼠體內擴大培養(yǎng)，將誘生腹水通過羥基磷灰石柱親和層析制備純品2E3，并用FITC標記，制備抗人CD13單抗FITC-2E3。7)通過競爭抑制實驗，明確2E3與已知常用抗人CD13單抗所識別CD13分子表位的異同。 結果：1)構建了重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)/CD13，經測序鑒定完全正確。2)共獲得7株大量穩(wěn)定分泌抗人CD13單克隆抗體的的雜交瘤克隆株。3)抗人CD13單抗類別均為IgM類，κ鏈。4)獲得抗人CD13

4、單抗純品2E3及熒光標記抗體FITC-2E3，經鑒定可用于FCM(流式細胞術)，適用于臨床白血病MFC-IM診斷。5)2E3與已知抗CD13單抗Leu-M7、WM15識別CD13分子不同表位。 結論：用基因免疫的方法，成功研制出抗人CD13單克隆抗體，并獲得純品2E3和熒光標記單抗FITC-2E3，不僅可用于MFC-IM檢測，并可以進一步對其相關生物學功能進行研究，使之可能用于科研或臨床治療。同時，結果表明，對于一些表達在細胞表