新型人源化抗CD20單克隆抗體的表達(dá)和活性檢測(cè).pdf

1、B細(xì)胞淋巴瘤是發(fā)生在B細(xì)胞的實(shí)體腫瘤，主要可以分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)。NHL在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中十分常見(jiàn)，對(duì)人類生命健康造成極其嚴(yán)重的威脅。但到目前為止，臨床上傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)NHL的治療效果并不理想，科學(xué)家正在研發(fā)各種新型藥物來(lái)治療NHL。單克隆抗體因?yàn)槠涓咛禺愋院桶邢蛐远l(fā)展迅速。B淋巴細(xì)胞抗原CD20是人類B淋巴細(xì)胞表面上所

2、特有的標(biāo)識(shí)，主要由297個(gè)氨基酸構(gòu)成。根據(jù)不同的磷酸化水平，CD20的分子量為33-37kD，屬于非糖基化磷蛋白。CD20分子是一種有四個(gè)跨膜區(qū)的跨膜蛋白，它的N端和C端都位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)側(cè)。CD20分子的主要抗原表位位于第三、四跨膜區(qū)之間，是一個(gè)由43個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀區(qū)域。從前體B細(xì)胞到后來(lái)的分化過(guò)程，CD20廣泛表達(dá)于B細(xì)胞的表面，但是不表達(dá)于晚期分化的漿細(xì)胞中。CD20表達(dá)于B細(xì)胞發(fā)展的除了最初和最后以外的所有階段。CD20在B細(xì)胞

3、淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病和黑色素瘤腫瘤干細(xì)胞中均被發(fā)現(xiàn)。CD20分子位于B細(xì)胞膜表面，抗體接近的空間位阻較小，因此CD20分子成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶點(diǎn)。雖然CD20的功能尚未完全清楚，但是它在Ca2+跨膜傳遞，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+聚集和B細(xì)胞激活方面發(fā)揮著重要作用。
　　Rituximab是一種與B細(xì)胞表面CD20分子特異性結(jié)合的人/鼠嵌合型單克隆抗體。Rituximab是一種糖基化IgG1κ免疫球蛋白，

4、其中鼠源來(lái)自于鼠抗CD20單抗的可變區(qū)Fab段，人源來(lái)自于人IgG1抗體穩(wěn)定區(qū)Fc段。Rituximab由1328個(gè)氨基酸組成，分子量約為144Kd。Rituximab由IDEC公司研發(fā)，藥品名稱是IDEC-C2B8。因?yàn)镽ituximab具有殺傷B細(xì)胞的功能因此被用于治療以B細(xì)胞過(guò)量表達(dá)，B細(xì)胞過(guò)度活化或B細(xì)胞功能失調(diào)為特點(diǎn)的相關(guān)疾病，例如:白血病、淋巴瘤、移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病?；谄渑R床試驗(yàn)中顯示的安全性和有效性，美國(guó)食品和

5、藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)在1997年批準(zhǔn)Rituximab用于治療對(duì)于其他化療方案無(wú)效的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。2010年歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)Rituximab用于濾泡性淋巴瘤初始治療后的維持治療。在三組隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，Rituximab已經(jīng)被證明是一種有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物，現(xiàn)在已經(jīng)批準(zhǔn)用于難治愈型類風(fēng)濕性疾病的治療。美國(guó)FDA批準(zhǔn)Rituximab與甲氨蝶呤(MTX)聯(lián)合用于治療對(duì)

6、抗TNFα治療反應(yīng)不足的中度至嚴(yán)重活動(dòng)性成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。在歐洲，Rituximab僅被批準(zhǔn)與甲氨蝶呤聯(lián)合治療抗TNFα治療反應(yīng)不足的嚴(yán)重活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。其他Rituximab治療的自身免疫性疾病包括:自身免疫性溶血性貧血、純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、埃文斯綜合癥、血管炎、大皰的皮膚疾病、Ⅰ型糖尿病、干燥綜合征、德維克病和Graves眼病等。
　　Rituximab是一種人鼠嵌合型的抗CD20單克

7、隆抗體，具有30％左右的鼠源蛋白，因此長(zhǎng)期使用會(huì)引起免疫原性。因此，尋求更為有效的抗CD20抗體用于B淋巴瘤的治療顯得尤為迫切。
　　我們通過(guò)計(jì)算機(jī)模建技術(shù)，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與Rituximab空間結(jié)構(gòu)最相近的人IgG1為骨架，將Rituximab的CDR區(qū)進(jìn)行移植和改造，通過(guò)重疊PCR方法，擴(kuò)增出目的基因片段。分別將輕、重鏈基因片段克隆到載體pcDNA3.3、Poptivec質(zhì)粒上。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293F細(xì)胞，收取細(xì)胞上清，

8、用rProteinA親和層析法純化目的抗體，并用SDS-PAGE檢驗(yàn)抗體的表達(dá)量，采用Fortebio技術(shù)檢測(cè)抗體與抗原的結(jié)合能力，最后進(jìn)行裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)抗體的抗腫瘤活性。結(jié)果顯示:抗體的輕、重鏈質(zhì)粒已經(jīng)被成功構(gòu)建，并且順利的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，最終純化得到13種目的抗CD20人源化抗體?？贵w在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為相對(duì)分子質(zhì)量約為25Kd和55Kd兩條帶，與預(yù)計(jì)條帶大小相符;Fortebio實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，13組抗體與抗原具

9、有良好的親和活性，其中:L4H7抗體的Kd值為1.91×10-9mol/L、L5H5抗體的Kd值為7.35×10-10mol/L、L5H7抗體的Kd值為1.91×10-9mol/L。裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)表明，L5H7抗體的抗腫瘤活性優(yōu)于Rituximab。下一步，我們將增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，進(jìn)一步驗(yàn)證抗體L5H7的抗腫瘤活性和安全性，以期獲得親和力更強(qiáng)，抗腫瘤活性更高并且副作用更少的安全有效的人源化抗CD20單克隆抗體，為臨床上NHL的