新型抗ige人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究

1、新型抗新型抗IgEIgE人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究錢衛(wèi)珠【摘要】：【摘要】：研究目的:I型超敏反應(yīng)又稱過敏反應(yīng)主要由特異性IgE抗體所介導(dǎo)由于IgE處于變態(tài)反應(yīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的最上游在變態(tài)反應(yīng)啟動和發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。1987年首次提出應(yīng)用抗IgE抗體治療IgE介導(dǎo)的過敏性疾病并描述了具有特異性結(jié)合能力的抗IgE單克隆抗體。1993年Kolbinger等報道了一株鼠源性單抗(MaE11)的人源化

2、過程該抗體又稱為Omalizumab或Xolair包括大約5%的鼠源和95%的人源序列。2003年6月美國FDA批準Xolair上市。上市伊始2004年在美國的銷售額即達到1.4億美元顯示出良好的市場前景。然而Xolair抗體與IgE的親和常數(shù)則僅有26nM左右當抗IgE抗體的治療濃度達到IgE基礎(chǔ)水平的100倍時才可結(jié)合99%的IgE分子從而充分抑制IgE分子與FcεR相結(jié)合。在過敏性哮喘患者體內(nèi)游離IgE水平可升高數(shù)倍Xolair抗

3、體的臨床用量需要根據(jù)IgE的基礎(chǔ)水平進行調(diào)整往往需要數(shù)百毫克才能達到治療效果。因此Xolair的治療費用十分昂貴即使在美國也受到醫(yī)療保險的限制目前僅用于吸入激素?zé)o法控制的嚴重病例。國外也有其它醫(yī)藥公司研制了抗IgE的人源化抗體(瑞士Novartis、美國Tanox公司)但由于其臨床療效尚不及Xolair均于1996年終止了臨床試驗。本研究利用哺乳動物表達系統(tǒng)制備了含有關(guān)鍵的功能表位的IgE片段(Fcε24)通過雜交瘤技術(shù)制備新型的高親和

4、力抗IgE單克隆抗體篩選具有競爭抑制IgE與其受體FcεR結(jié)合功能的克隆。為降低鼠源單抗的免疫原性對篩選獲得的抗體進行人源化改造比較制備所獲抗體及Xolair與IgE結(jié)合的親和力及體外功能以期從結(jié)構(gòu)上闡明該抗體的作用機制。通過該課題的研究以期獲得親和力更高的、可望用于過敏性疾病預(yù)防和治療的新型抗IgE人源化單克隆抗體。研究方法:本課題采用小鼠雜交瘤技術(shù)利用IgEFcε24作為免疫原免疫獲得具有競爭抑制IgE與FcεR結(jié)合功能的鼠源單克隆

5、抗體。為進一步降低單抗的免疫原性減輕用于人體時的HAMA反應(yīng)提高安全性我們采用計算機輔助設(shè)計模擬抗體空間構(gòu)象的方法對鼠源抗體進行了人源化改造對改造成功的人源化單克隆抗體體外功能進行了詳細分析并與Omalizumab的體外功能進行比較。我們應(yīng)用噬菌體隨機七肽庫對人源化單克隆抗體的抗原表位進行親和淘選從而明確抗體識別的表位通過分析IgE與其高親和力受體FcεRIα的復(fù)合物結(jié)晶與抗IgE抗體所識別表位進行比較從空間結(jié)構(gòu)上解釋和闡明抗IgE人源

6、化單克隆抗體的功能學(xué)基礎(chǔ)。結(jié)果:獲得哺乳動物細胞表達的IgEFcε24以及FcεRIA通過雜交瘤技術(shù)篩選獲得具有競爭抑制IgE與FcεR結(jié)合的鼠源抗IgE單克隆抗體7A5。利用計算機輔助設(shè)計的手段改造獲得親和力和特異性均較好的人源化抗IgE體Hu7A5m18。體外功能分析結(jié)果表明:Hu7A5m18可抑制IgE與可溶性及細胞表面FcεRI結(jié)合而對結(jié)合于細胞表面FcεRI的IgE則無影響Hu7A5m18可以抑制IgE與細胞表面FcεRI結(jié)合

7、導(dǎo)致的脫顆粒反應(yīng)。Hu7A5m18介導(dǎo)上述體外功能的EC50僅為Omalizumab的110左右。SPR技術(shù)檢測M7A5、Hu7A5m18及Omalizumab與IgE的親和力分別為1.9nM、1.7nM和23.8nM因此Hu7A5m18人源化改造成功而且該單抗的親和力明顯高于Omalizumab。我們應(yīng)用噬菌體隨機七肽庫對Hu7A5m18的抗原表位進行親和淘選通過對陽性噬菌體序列的分析比對發(fā)現(xiàn)一個非常保守的序列被高度擴增而這個序列與I

8、gE恒定區(qū)Cε3片段內(nèi)的391KQR393高度同源。通過分一、材料5152（一）重組蛋白、抗體及細胞系51（二）試劑5152（三）主要儀器設(shè)備52二、方法5257（一）Hu7A5m18抑制IgE與可溶性FcεRI的結(jié)合實驗5254（二）Hu7A5m18抑制IgE與細胞表面FcεRI的結(jié)合實驗5455（三）Hu7A5m18與結(jié)合于細胞表面FcεRI的IgE的結(jié)合實驗5556（四）Hu7A5m18抑制IgE引起脫顆粒的功能學(xué)實驗5657三、

9、結(jié)果5768（一）Hu7A5m18抑制IgE與可溶性FcεRI結(jié)合5762（二）Hu7A5m18抑制IgE與細胞表面FcεRI結(jié)合6266（三）Hu7A5m18不與結(jié)合于細胞表面FcεRI的IgE的結(jié)合6667（四）Hu7A5m18抑制IgE導(dǎo)致的脫顆粒6768四、討論6870第三部分抗IgE人源化單抗Hu7A5m18的結(jié)構(gòu)研究7085一、材料7072（一）菌株、噬菌體隨機文庫及抗體70（二）試劑配制7072（三）實驗設(shè)備、器材72二、

10、方法7276（一）噬菌體隨機肽庫篩選Hu7A5m18抗原表位7276（二）Hu7A5m18抗原表位的鑒定76三、結(jié)果7684（一）噬菌體隨機肽庫篩選Hu7A5m18抗原表位7680（二）Hu7A5m18抗原表位的鑒定8084四、討論8485參考文獻8589綜述89109參考文獻104109在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明109112致謝112專家共識：外用中成藥在濕疹皮炎治療中的應(yīng)用2012122114:59來源：愛愛醫(yī)我要評論(