抗人神經(jīng)膠質(zhì)瘤單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Gliolma)是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，它起源于神經(jīng)組織中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種癌細(xì)胞起源、病理結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特征和臨床癥狀都很特殊的腫瘤，其惡性程度高且術(shù)后易復(fù)發(fā)，目前采用的手術(shù)、化療、放療三大常規(guī)治療措施的效果均不理想，原因在于上述方法屬減數(shù)性治療，無(wú)法徹底清除殘留細(xì)胞。人們關(guān)注著開拓新的治療途徑，在免疫治療中，腫瘤單抗和腫瘤疫苗是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，其核心是找到腫瘤的特異抗原或相關(guān)抗原，目前，雖然還未發(fā)

2、現(xiàn)膠質(zhì)瘤特異抗原，但膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原的存在已得到人們的確認(rèn)，這類抗原為膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面所特有。80年代早期開始，利用雜交瘤技術(shù)，將人腦膠質(zhì)瘤培養(yǎng)細(xì)胞系LN-18和SHG-44作為抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，克隆化培養(yǎng)后獲得分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株?？鼓z質(zhì)瘤單克隆抗體被應(yīng)用于膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)研究和診斷治療以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗原的分析，因其效價(jià)高，特異性好的優(yōu)勢(shì)，在膠質(zhì)瘤的免疫生物學(xué)以及免疫治療方面取得了突破性的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)利用人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(S

3、KN-SH)作為抗原免疫BALB/c小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合、克隆化培養(yǎng)，旨在建立新的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單克隆抗體的生物學(xué)特性尚有待于研究，可能為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷及治療提供新的制劑，并為基因工程抗體的研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.抗原的制備傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞是較常用的一種抗原，其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞單一，易于獲得，實(shí)驗(yàn)方便及便于重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用SKN-SH細(xì)胞作為抗原，這種顆粒性的抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，可以不加佐劑，直接免疫小鼠。

4、 2.免疫方案 常用的免疫途徑包括皮下、靜脈、腹腔和肌肉注射。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射免疫，其是刺激脾的最佳方法。收集SKN-SH細(xì)胞6×10<'7>，離心洗滌，經(jīng)腹腔注射進(jìn)行初次免疫，間隔1周后，再取同量細(xì)胞追加免疫3次，每次間隔1周。末次加強(qiáng)免疫后 3d 取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合為最佳時(shí)機(jī)。 3．小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(SP2/0)細(xì)胞的準(zhǔn)備為避免細(xì)胞出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，應(yīng)用含8-AG的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)，增加對(duì) HAT 的敏感性，有

5、利于融合率的提高，使用濃度為20μag/ml，誘導(dǎo)1個(gè)月后，改用含10﹪胎牛血清的RPMI 1640(以下簡(jiǎn)稱1640)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行融合。 4．細(xì)胞融合 取已免疫的小鼠脾臟，收集脾細(xì)胞，分別吸取1×10<'8> 個(gè)脾細(xì)胞與4×10<'7>個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按2∶1進(jìn)行融合，通過(guò)HAT選擇性培養(yǎng)，使雜交瘤細(xì)胞增殖并形成克隆。 5．ELISA檢測(cè)融合后 10d，細(xì)胞克隆長(zhǎng)大約占孔底

6、面積的 1/3～1/2，每個(gè)孔內(nèi)含1個(gè)或幾個(gè)克隆。此時(shí)應(yīng)在末次換液后 2d 內(nèi)及時(shí)對(duì)細(xì)胞克隆的培養(yǎng)上清做ELISA檢測(cè)。首先裂解SKN-SH細(xì)胞提取蛋白質(zhì)做陽(yáng)性抗原包被96孔板，SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清做陰性對(duì)照包被96孔板，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)，然后篩選出分泌特異性單克隆抗體的陽(yáng)性孔。 6．克隆化培養(yǎng)由于融合初期形成的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體易丟失，因此細(xì)胞克隆一經(jīng)檢測(cè)為分泌抗體的陽(yáng)性克隆，就應(yīng)及時(shí)進(jìn)行

7、克隆化培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，該法操作簡(jiǎn)便，不需特殊設(shè)備，是最常用的方法。其原理是將細(xì)胞懸液進(jìn)行系列稀釋，為確保出現(xiàn)單個(gè)克隆，每次克隆應(yīng)稀釋為3種細(xì)胞濃度，即5個(gè)/ml、10個(gè)/ml、30個(gè)/ml，然后每孔加100μl，理論上計(jì)算每個(gè)孔分別含0.5個(gè)、1個(gè)和3個(gè)細(xì)胞，一般總能得到單克隆孔。經(jīng)過(guò)3次的克隆化培養(yǎng)，直至細(xì)胞克隆分泌抗體的陽(yáng)性率達(dá)100﹪，將雜交瘤細(xì)胞予以凍存。 7．腹水的收集將雜交瘤細(xì)胞大量傳代培養(yǎng)后，

8、收集細(xì)胞并接種于經(jīng)降脂烷預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔，14d后收集含單抗的腹水。 8．復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞由于雜交瘤細(xì)胞不宜在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，防止變異丟失，凍存的細(xì)胞應(yīng)每隔1～2年復(fù)蘇出來(lái)，檢測(cè)抗體分泌情況，必要時(shí)再進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。結(jié)果： 1.經(jīng)HAT選擇性培養(yǎng)后，74孔出現(xiàn)由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的集落，即細(xì)胞克??； 2.對(duì)形成細(xì)胞克隆的孔進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出24個(gè)分泌特異性抗體的陽(yáng)性孔； 3.從抗體分泌陽(yáng)性的孔中