PEG修飾鼠抗人CD3單克隆抗體的研究.pdf

1、目前，抗CD3單克隆抗體己廣泛應用于臨床治療器官移植后排斥反應，療效顯著，但機體易產(chǎn)生特異性免疫反應，導致鼠源性抗CD3單克隆抗體被快速清除，半衰期明顯縮短，從而限制了其治療作用。PEG修飾蛋白是蛋白類藥物二次開發(fā)中的一項熱點技術，PEG與藥物相連，能有效延長藥物的半衰期，降低藥物的免疫原性。本文利用PEG修飾鼠源性抗CD3單克隆抗體，擬有效改善其生物學活性，提高臨床應用效果。 本實驗首先以胃蛋白酶酶解鼠抗人CD3單克隆抗體，然

2、后通過凝膠層析分離及超濾純化得到抗體Fab'，并利用SDS-PAGE檢測純度。通過單因素試驗確定胃蛋白酶與抗體的物質(zhì)量之比為2:100，消化24h，反應體系pH值為3.0及溫度為37℃的酶解條件，以及巰基乙醇摩爾濃度為0.1mol/L，消化30min的F(ab')2制備Fab'抗體反應條件。結果得到純度較高的抗體Fab'，并利用薄層掃描純度均達到95％以上。 接著利用PEG-SPA修飾抗體和抗體片段Fab'，并對鼠抗人抗CD3單

3、克隆抗體和抗體片段的PEG化反應條件進行了優(yōu)化。通過正交確定了較佳的修飾工藝條件。結果表明，在pH9.0硼酸緩沖液，反應溫度25℃，抗體濃度0.2mg/ml，抗體和PEG摩爾比為1:20，反應3小時，所得到的修飾效果最好。 其次通過PEG化抗體IgG和抗體片段Fab'的體內(nèi)以及體外T細胞增殖實驗，考察了修飾后的抗體和抗體片段的免疫活性，實驗結果顯示：修飾后抗CD3單抗全抗，對T淋巴細胞增殖抑制活性下降了32.28％，抗體Fab'

4、下降了7.96％，PEG化Fab'下降了19.92％，其對T細胞抑制率有所下降，但細胞毒性增強不明顯。 最后利用ELISA法測血液中修飾后的抗體和抗體片段的半衰期。結果顯示：mPEG修飾后抗體和抗體片段血藥濃度降低明顯減緩，修飾后抗CD3抗體半衰期從2.658347h延長到8.722217h，延長了3.28倍。而修飾后抗體Fab'片段半衰期從2.209713h延長到4.1723h，延長了1.895倍。 由此我們可發(fā)現(xiàn)，利