PEG修飾鼠抗人CD3單克隆抗體的研究.pdf

1、目前，抗CD3單克隆抗體己廣泛應(yīng)用于臨床治療器官移植后排斥反應(yīng)，療效顯著，但機(jī)體易產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致鼠源性抗CD3單克隆抗體被快速清除，半衰期明顯縮短，從而限制了其治療作用。PEG修飾蛋白是蛋白類(lèi)藥物二次開(kāi)發(fā)中的一項(xiàng)熱點(diǎn)技術(shù)，PEG與藥物相連，能有效延長(zhǎng)藥物的半衰期，降低藥物的免疫原性。本文利用PEG修飾鼠源性抗CD3單克隆抗體，擬有效改善其生物學(xué)活性，提高臨床應(yīng)用效果。 本實(shí)驗(yàn)首先以胃蛋白酶酶解鼠抗人CD3單克隆抗體，然

2、后通過(guò)凝膠層析分離及超濾純化得到抗體Fab'，并利用SDS-PAGE檢測(cè)純度。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定胃蛋白酶與抗體的物質(zhì)量之比為2:100，消化24h，反應(yīng)體系pH值為3.0及溫度為37℃的酶解條件，以及巰基乙醇摩爾濃度為0.1mol/L，消化30min的F(ab')2制備Fab'抗體反應(yīng)條件。結(jié)果得到純度較高的抗體Fab'，并利用薄層掃描純度均達(dá)到95％以上。 接著利用PEG-SPA修飾抗體和抗體片段Fab'，并對(duì)鼠抗人抗CD3單

3、克隆抗體和抗體片段的PEG化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)正交確定了較佳的修飾工藝條件。結(jié)果表明，在pH9.0硼酸緩沖液，反應(yīng)溫度25℃，抗體濃度0.2mg/ml，抗體和PEG摩爾比為1:20，反應(yīng)3小時(shí)，所得到的修飾效果最好。 其次通過(guò)PEG化抗體IgG和抗體片段Fab'的體內(nèi)以及體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，考察了修飾后的抗體和抗體片段的免疫活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：修飾后抗CD3單抗全抗，對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖抑制活性下降了32.28％，抗體Fab'

4、下降了7.96％，PEG化Fab'下降了19.92％，其對(duì)T細(xì)胞抑制率有所下降，但細(xì)胞毒性增強(qiáng)不明顯。 最后利用ELISA法測(cè)血液中修飾后的抗體和抗體片段的半衰期。結(jié)果顯示：mPEG修飾后抗體和抗體片段血藥濃度降低明顯減緩，修飾后抗CD3抗體半衰期從2.658347h延長(zhǎng)到8.722217h，延長(zhǎng)了3.28倍。而修飾后抗體Fab'片段半衰期從2.209713h延長(zhǎng)到4.1723h，延長(zhǎng)了1.895倍。 由此我們可發(fā)現(xiàn)，利