鼠抗人CD40突變體單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、CD40是分子量為45～50KD的I型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，表達(dá)于多種抗原遞呈細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞。通過單克隆抗體激發(fā)CD40分子不僅可以直接作用于表達(dá)CD40分子的腫瘤細(xì)胞，其介導(dǎo)的信號(hào)還可在多個(gè)環(huán)節(jié)影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展，如調(diào)控細(xì)胞增殖/凋亡，增強(qiáng)其它治療手段的敏感性，此外還能通過調(diào)節(jié)適應(yīng)性和固有免疫應(yīng)答而起到抗腫瘤作用。然而由于CD40在體內(nèi)正常組織的廣泛

2、表達(dá)，三株抗人CD40單抗雖然已進(jìn)入美國(guó)臨床前期試驗(yàn)，但其存在的副作用和安全性問題仍引起高度關(guān)注。本科室以往的研究發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞株和新鮮腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD40突變體(CD40mu)(CAC→CAA,78His→78Gln)(NCBIAssay Id：ss23134804，Reference SNPId：rs17177493)，該突變位點(diǎn)位于CD40胞外段第二個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，這一區(qū)域是CD40與CD40L(CD154)相互作用的重要

3、區(qū)域?；蜣D(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建進(jìn)一步證實(shí)了該突變體與抗體的結(jié)合能力與野生型CD40截然不同，CD40mu胞外段一個(gè)氨基酸的突變可導(dǎo)致局部結(jié)構(gòu)改變而形成新的抗原表位，該抗原表位為CD40mu所特有，CD40mu在腫瘤中的表達(dá)特點(diǎn)和生物學(xué)意義以及單抗激發(fā)CD40mu對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響有待進(jìn)一步研究。 1．分泌鼠抗人CD40mu單抗的雜交瘤細(xì)胞株的制備利用已成功構(gòu)建的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD40mu為免疫原，免疫BALB/c小鼠，

4、采用B淋巴細(xì)胞融合技術(shù)，將反復(fù)免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，以突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD40mu為陽性篩選細(xì)胞，以野生型CD40基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD40wt為陰性篩選細(xì)胞，通過間接免疫熒光標(biāo)記法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得四株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD40mu單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3G5、5H6、389和286，前三株抗體的重鏈為IgG1，286的重鏈為Igb2

5、a，輕鏈均為K鏈。四株抗體均可用于免疫組織化學(xué)分析，其中3G5和286可用手Western-blot檢測(cè)。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長(zhǎng)良好，穩(wěn)定分泌抗體。 2．鼠抗人CD40mu單克隆抗體的體外生物學(xué)特性研究運(yùn)用成功制備的單抗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分惡性B細(xì)胞株及上皮性腫瘤細(xì)胞株表達(dá)CD40mu，其在新鮮腫瘤組織中也有高水平的表達(dá)。四株抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)不同，對(duì)細(xì)胞株的識(shí)別譜也不相同。繼而采用抗CD

6、40mu單抗對(duì)表達(dá)CD40mu的人卵巢癌細(xì)胞株H08910和人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)初步表明，單抗286能夠促進(jìn)H08910細(xì)胞和K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使H08910細(xì)胞進(jìn)入S期的比例增加和細(xì)胞因子IL-6的分泌，而另一株單抗3G5則能夠誘導(dǎo)表達(dá)CD40mu分子的細(xì)胞株H08910細(xì)胞凋亡。 綜上所述，本研究成功制備了四株特異性鼠抗人CD40mu單克隆抗體，并初步探討了CD40mu在腫瘤中的表達(dá)及其生物學(xué)意義，證實(shí)了