抗人CD44單克隆抗體HI313生物學(xué)功能研究及其單鏈抗體的構(gòu)建.pdf

1、實驗?zāi)康模禾接懶∈罂谷薈D44單克隆抗體(HI313)對髓系白血病細胞增殖、分化的影響。構(gòu)建HI313單鏈抗體(ScFv)，為進一步治療性抗體開發(fā)打下基礎(chǔ)。 實驗方法：通過流式細胞儀檢測，比較小鼠抗人CD44單克隆抗體HI313與HI44a的親合力及競爭抑制作用；以胎盤蘭計數(shù)和MTS法檢測HI313對白血病細胞系增殖抑制的影響；AnnexinV/PI和TheCycleTESETMPLUSDNAReagentKit檢測HI313對

2、NB4細胞凋亡及細胞周期影響；以及HI313對AML病人血細胞誘導(dǎo)分化作用；RT-PCR的方法克隆小鼠雜交瘤HI313的抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，利用overlap-PCR方法構(gòu)建HI313-ScFv融合基因，定向克隆入原核表達載體pET22b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b/HI313-SeFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BL21感受態(tài)菌株，在IPTG存在條件下，誘導(dǎo)表達HI313單鏈抗體。所得融合蛋白經(jīng)復(fù)性、鎳柱純化后，通過流式細胞術(shù)檢測其與天然細胞

3、膜CD44蛋白的結(jié)合活性和特異性。 實驗結(jié)果：通過THP-1和KGla細胞的檢測，HI313克隆的相對親合力分別為1.2nM和1.34nM；H144a克隆的相對親和力分別為3.5nM和5.89nM；免疫競爭實驗表明HT313與HI44a識別不同抗原表位；HI313單克降抗體對NB4白血病細胞系具有強烈的抑制增殖作用，并使NB4細胞周期停留在G0/G1期；對AML病人血細胞誘導(dǎo)分化作用結(jié)果顯示HI313可使髓系表面的成熟標志表達量

4、增加。擴增HI1313重鏈可變區(qū)基因357bp，HI313輕鏈可變區(qū)基因339bp；成功構(gòu)建HI313-ScFv單鏈抗體，能與KGla細胞表面抗原結(jié)合。 實驗結(jié)論：HI313單克隆抗體具有高親和力；且與H144a克隆結(jié)合的不是一個抗原表位；HI313對NB4細胞具有增殖抑制作用，作用機制可能與阻滯細胞周期于G0/G1期相關(guān)；HI313能有效誘導(dǎo)AML病人血細胞的分化，并對AML病人的各亞型有一定的促分化作用，提示此抗體具有針對A