氯嘧磺隆單克隆抗體的制備及其單鏈抗體基因的克隆.pdf

1、本文報道了除草劑氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl，俗稱豆磺隆)單克隆抗體的制備、酶聯(lián)免疫檢測法和膠體金免疫層析試紙條快速檢測法的建立以及抗氯嘧磺隆單鏈抗體基因的克隆。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 試驗采用2-(氨基磺?；?苯甲酸乙酯通過琥珀酸酐法合成了半抗原，用活性酯法將活化的半抗原與載體蛋白BSA和OVA交聯(lián)，制備了氯嘧磺隆人工抗原。定量分析結(jié)果表明，半抗原與BSA的交聯(lián)比為16：1，與OVA的交聯(lián)比為12：1。用人工

2、抗原(半抗原-BSA)免疫Balb/c小鼠，iC-ELISA試驗結(jié)果表明，5只小鼠抗血清效價可達0.4-1.6×104，證明抗血清中有氯嘧磺隆特異性抗體產(chǎn)生。 成功篩選出抗氯嘧磺隆單克隆抗體，并建立了優(yōu)化的ELISA檢測方法。小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，用克隆技術(shù)共篩選到8株分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株。用擴增培養(yǎng)后的1F5C5A10雜交瘤細胞株誘導小鼠腹水，單克隆抗體經(jīng)硫酸銨和親和層析純化，其效價為6.4×104，親

3、和常數(shù)為3.27×109L/mol，屬于IgG1亞類，輕鏈為κ型；單克隆抗體的特異性較強，與氯嘧磺隆結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應率分別只有0.1％-2.2％。iC-ELISA試驗表明，常規(guī)iC-ELISA和簡化后的iC-ELISA的IC50值分別為11.6ng/mL，28.7ng/mL，最適測定范圍分別為1.6-84ng/mL和2.2-372ng/mL，從結(jié)果可以看出，兩種用單抗所建立的ELISA法同前人所報道的用化學特異性的多抗所建立的ELI

4、SA法(54ng/mL)相比，其IC50值均顯著地降低。添加試驗中，水樣中的氯嘧磺隆檢測范圍為1-500ng/mL，常規(guī)iC-ELISA的平均回收率為90％，數(shù)值在74％-114％之間；簡化iC-ELISA法的平均回收率也為90％，但變幅范圍較窄，為84％-102％。土壤中的氯嘧磺隆濃度范圍0.02-1.25μg/g，常規(guī)iC-ELISA平均回收率為256％，數(shù)值在216％-326％之間；簡化的iC-ELISA平均回收率112％，數(shù)值變

5、幅從99％到129％。顯然，簡化的iC-ELISA的檢測結(jié)果好于常規(guī)iC-ELISA。 建立了氯嘧磺隆的膠體金免疫層析試紙條快速檢測法。利用膠體金標記的氯嘧磺隆單克隆抗體，半抗原-牛血清白蛋白和羊抗鼠IgG，制備了氯嘧磺隆膠體金免疫檢測試紙條，該試紙條的最低檢測極限為100ng/mL，檢測時間10min。8個土壤樣品分別添加0-2000ng/g的氯嘧磺隆標樣，提取2h后用氣相色譜和試紙條進行檢測，如果以100ng/g作為陽性與陰

6、性樣品的區(qū)分標準，試紙條檢測結(jié)果和氣相色譜所測的結(jié)果完全一致。所制備的膠體金免疫檢測試紙條可以用于土壤中氯嘧磺隆殘留的檢測。 克隆了抗氯嘧磺隆單鏈抗體基因片段。以雜交瘤細胞總RNA為模板，Oligo(dT)作引物，采用RT-PCR技術(shù)，合成了cDNA第一鏈。根據(jù)小鼠單克隆抗體可變區(qū)存在相對保守序列的特性，設計了相應引物，擴增了單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。DNA序列測定和國際互聯(lián)網(wǎng)檢索結(jié)果表明：得到的抗氯嘧磺隆單克隆抗體VH和

7、VL基因全長分別為342和332個bP，可分別編碼114和110個氨基酸。VH基因與基因庫中小鼠IgVH基因的同源性高達98％，氨基酸與小鼠Ig的同源性達86％，應歸屬于小鼠IgVH基因。VL基因與基因庫中的小鼠IgVL基因的同源性達99％，氨基酸與小鼠IgVL氨基酸的同源達95％，應歸屬于小鼠IgVL基因。采用SOE-PCR法構(gòu)建了抗氯嘧磺隆單鏈抗體基因，在其兩端分別加上了Xho1和ECoR1酶切位點，該基因長719bp，可編碼239