玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及噬菌體單鏈抗體的篩選.pdf

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的真菌毒素，主要污染玉米、大麥、小麥、燕麥和高粱等作物。ZEN除具有很強(qiáng)雌激素樣作用可產(chǎn)生生殖毒性外，還具有免疫毒性、肝毒性、遺傳毒性、潛在致癌性。該毒素可通過(guò)污染了ZEN的谷物及其制品或者殘留有ZEN的肉、奶等進(jìn)入動(dòng)物和人體內(nèi)，給畜牧業(yè)和人類健康造成威脅。
　　對(duì)ZEN進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)是預(yù)防和控制其危害的有效手段。我國(guó)《GB13078.2-2006飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)-

2、飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》要求，配合飼料、玉米中的ZEN允許量為500μg/kg。2011年出臺(tái)的《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了谷物及其制品中ZEN限量為60μg/kg。只有根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)飼料和谷物及其制品中的ZEN進(jìn)行準(zhǔn)確有效的檢測(cè)才能從源頭上杜絕ZEN對(duì)畜牧行業(yè)和人類健康的威脅。目前，用于檢測(cè)ZEN的方法有高效液相色譜法、氣相色譜、薄層層析法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及免疫學(xué)檢測(cè)方法等。其中免疫

3、學(xué)檢測(cè)方法的前處理簡(jiǎn)單、操作易掌握而且便特異性強(qiáng)、靈敏度高。這使得免疫學(xué)檢測(cè)方法成為被廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法。
　　高品質(zhì)抗體是免疫學(xué)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)制備了可穩(wěn)定分泌抗ZEN的單克隆抗體細(xì)胞株，并從雜交瘤細(xì)胞株中提取RNA，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得了抗ZEN陽(yáng)性噬菌體單鏈抗體，為從基因工程抗體途徑獲得ZEN免疫學(xué)檢測(cè)中所需要的高品質(zhì)抗體奠定了基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)Ⅰ玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備本試驗(yàn)用ZEN與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中

4、反應(yīng)生成玉米赤霉烯酮肟(ZEN-CMO)，用紫外連續(xù)波譜掃描法對(duì)ZEN-CMO進(jìn)行鑒定，同時(shí)計(jì)算ZEN-CMO的肟化率;用活性酯法將ZEN-CMO與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)合成免疫抗原;用醛法將ZEN與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)合成包被抗原，用紫外連續(xù)波譜掃描法對(duì)免疫抗原與包被抗原進(jìn)行鑒定;通過(guò)常規(guī)免疫和聯(lián)合脾內(nèi)免疫獲得的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合，用間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)其特異性。結(jié)果表

5、明:ZEN-CMO合成成功，肟化率為65.0％;免疫抗原與包被抗原合成成功;篩選到一株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞將其命名為4C8;經(jīng)鑒定4C8抗體亞型為IgG2b，輕鏈為κ鏈;染色體平均計(jì)數(shù)為104條;SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)約為25kDa、50kDa的兩條蛋白條帶;間接ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)為1∶512，腹水效價(jià)為1∶9600，純化腹水蛋白濃度為1.639g/L;細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)ZEN具有特異性。以上結(jié)果說(shuō)明:雜交瘤細(xì)胞株4C8可用于玉米

6、赤霉烯酮單鏈抗體的制備。
　　試驗(yàn)Ⅱ玉米赤霉烯酮噬菌體單鏈抗體的篩選與表達(dá)從已篩選得到的雜交瘤細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL，將Linker與VH、VL通過(guò)SOE-PCR按VH-Linker-VL方式拼接成scFv片段，將scFv基因和pCANTAB5E載體分別用sfiⅠ和NotⅠ雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化E.coliTG1，經(jīng)過(guò)輔助噬菌體M13K07的挽救，構(gòu)建噬菌體單鏈抗體的初級(jí)抗體庫(kù);以ZEN-

7、OVA為包被抗原，進(jìn)行富集篩選，將陽(yáng)性噬菌體抗體庫(kù)上清感染E.coliHB2151用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明:經(jīng)過(guò)3輪的親和富集后抗體庫(kù)總富集倍數(shù)達(dá)到66.2倍，滴度達(dá)到3.7×106cfu/mL，通過(guò)phage-ELISA篩選出3株特異性抗ZEN的單鏈抗體菌株;用IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)35kDa左右的可溶性目的蛋白，用BandScan軟件分析目的蛋白表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)溫度為30℃，IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/mL，最佳誘導(dǎo)