谷物樣品中基于抗獨特型納米抗體噬菌體的玉米赤霉烯酮超靈敏熒光定量PCR方法的建立.pdf

1、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是一種在食品中常見的真菌毒素，主要由禾谷鐮刀菌，大刀鐮刀菌，木賊鐮刀菌等產生。ZEN具有廣泛毒性，包括致畸性、致癌性、基因毒性、肝毒性，并可引起免疫抑制和生殖問題。對食品中的ZEN開展快速檢測對于保障食品安全具有重要意義。
　　本研究以抗ZEN單克隆抗體為配基，投入羊駝的天然噬菌體展示納米抗體庫，采用固相淘選的方法，獲得了可特異性結合ZEN抗體的抗獨特型納米抗體，將其作為ZEN全抗原的

2、替代物，結合熒光定量PCR技術，建立了基于噬菌體展示納米抗體的熒光定量PCR檢測ZEN的方法；通過分子克隆技術，構建了納米抗體的原核表達載體，實現(xiàn)了所獲納米抗體的可溶性表達，為實現(xiàn)基于納米抗體的ZEN全抗原生物合成及無害化替代提供了基礎，主要研究內容和成果如下：
　　1.采用生物淘選方法篩選得到2種ZEN抗獨特型納米抗體序列，分別命名為Z1、Z6，并分別建立了基于Z1、Z6的標準曲線，其IC50分別為0.25±0.02 ng/mL

3、，0.49±0.03 ng/mL，其靈敏度與化學合成抗原（ZEN-BSA）相比分別提高了26倍和13倍。
　　2.選取所淘選到的噬菌體納米抗體克隆Z1，以噬菌體粒子為DNA模板，針對噬菌體質粒VHH片段設計特異性引物，建立了基于噬菌體克隆Z1的熒光定量PCR方法（PD-IPCR），該方法的最低檢測限為6.5 pg/mL，線性范圍為0.01~100 ng/mL，變異系數(shù)（CV）5.51~28.12％，與三種常見的真菌毒素AFB1，

4、DON和OTA的交叉反應率均小于0.01%。加標回收實驗結果顯示，三種谷物樣本的加標回收率為78~122.4%。分別采用PD-IPCR和LC-M對玉米、小麥和大米共35個實際樣本進行了檢測，結果顯示兩種方法的線性相關系數(shù)為R2=0.993。
　　3.采用分子生物學技術，構建了納米抗體的原核表達載體，經IPTG誘導表達及鎳柱純化后，獲得可溶性的ZEN抗獨特型納米抗體BMP-Z1和BMP-Z6，實現(xiàn)了基于納米抗體的ZEN全抗原生物合成