玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及高通量定性、定量檢測技術(shù)的研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，為具有雌性激素活性的真菌毒素。ZEN具有很強的生殖毒性、致畸性和免疫抑制毒性等，人或動物長期食用被ZEN污染的食物或飼料，會對機體造成損害。盡管我國目前對飼料、谷物和谷物食品中的ZEN檢測通常采用高效液相色譜、液-質(zhì)聯(lián)用色譜等方法，但這些方法遠不能滿足不同樣本中ZEN等真菌毒素的不同檢測需求。本文通過研制抗ZEN單克隆抗體，進而基于免疫層析、免疫傳感、化學

2、發(fā)光、液相芯片等原理與技術(shù)，建立了多種具有自主知識產(chǎn)權(quán)的快速、靈敏、高通量的免疫學檢測方法，為監(jiān)測谷物、谷物食品、飼料、動物源性食品中ZEN及其他真菌毒素的殘留提供技術(shù)支撐。
　　ZEN是一種半抗原，為了制備其完全抗原，首先合成了玉米赤霉烯酮-6-羧甲氧肟，再通過碳二亞胺法與牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，制備出完全抗原BSA-ZEN和OVA-ZEN。以BSA-ZEN為免疫原，免疫BALB/c小鼠后，取免疫小鼠的

3、脾臟與SP2/0細胞融合。通過3次篩選和亞克隆，最終獲得了4株穩(wěn)定分泌抗ZEN單克隆抗體的雜交瘤細胞株。選擇其中效價最高的2C9細胞株，建立了檢測ZEN的競爭ELISA方法。其檢測限（IC10，即10％抑制濃度）為0.051 ng/mL。交叉反應(yīng)結(jié)果表明，該抗體對ZEN結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率為16％，與伏馬毒素B1、嘔吐毒素和黃曲霉毒素B1均無交叉反應(yīng)。
　　為了解決大批量樣品的現(xiàn)場、快速初篩需求，本文基于競爭ELISA和免疫層析

4、原理，建立了定性和定量免疫膠體金試紙條檢測技術(shù)。分別用粒徑25 nm的膠體金標記抗ZEN單克隆抗體和抗伏馬毒素B1(FB1)單克隆抗體，制成膠體金標記抗體墊，以硝酸纖維素膜為層析介質(zhì)，分別包被ZEN偶聯(lián)抗原(BSA-ZEN)和FB1偶聯(lián)抗原(OVA-FB1)作為檢測線，包被羊抗鼠二抗作為質(zhì)控線。在對試紙條制備材料、緩沖液組成和pH、添加物種類和濃度、樣品稀釋度、包被抗原濃度以及金標抗體濃度等進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，組裝成試紙條，建立了同時檢測

5、谷物中ZEN和FB1的雙重定性和定量膠體金試紙條分析方法。雙重定性試紙條對標準品中ZEN和FB1的檢測限分別為6 ng/mL和50 ng/mL。雙重定量試紙條對ZEN的檢測區(qū)間為0.94-7.52 ng/mL，檢測限為0.35 ng/mL;對FB1的檢測區(qū)間為9.34-100.45 ng/mL，檢測限為5.23 ng/mL。試紙條的檢測方法不但快速，較此前報道的方法大幅提升了檢測靈敏度。
　　為了實現(xiàn)特定樣品中玉米赤霉烯酮的高靈敏

6、檢測，利用堿性磷酸酶可以將無色、無電化學活性的對硝基苯磷酸轉(zhuǎn)化為黃色、有電化學活性的對硝基苯酚的原理，將ELISA與電化學檢測技術(shù)結(jié)合，建立定量檢測分析方法。通過對反應(yīng)緩沖液種類、pH、電化學參數(shù)、包被抗原濃度、抗體濃度等的優(yōu)化，檢測靈敏度可達0.002 ng/mL，檢測區(qū)間為0.004-9.5ng/mL。該方法不但拓寬了檢測區(qū)間，還可實現(xiàn)高通量、高靈敏、快速檢測食品等樣本中痕量的真菌毒素。
　　基于化學發(fā)光和信號放大系統(tǒng)可提高檢

7、測體系的靈敏度，本文在ELISA的基礎(chǔ)上，通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)、納米金系統(tǒng)的逐個加入，建立了三種直接競爭化學發(fā)光免疫檢測方法。通過對各方法中反應(yīng)試劑濃度、孵育時間、甲醇濃度等的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)隨著信號放大系統(tǒng)的加入，檢測限逐漸提升，基于納米金系統(tǒng)建立的化學發(fā)光免疫方法檢測限可至0.008 ng/mL。該方法首次將兩種信號放大策略同時使用，并將雙標記納米金(double-codified gold nanoparticles)技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)

8、業(yè)和食品檢測領(lǐng)域，為樣本中痕量分析物的檢測提供了又一種快速、精準的技術(shù)。
　　為了高效檢測谷物中易同時出現(xiàn)的多種真菌毒素（ZEN、FB1、嘔吐毒素和黃曲霉毒素B1），本文將四種抗真菌毒素單克隆抗體分別包被在不同編碼的聚苯乙烯微球（49、39、37、19號）表面，并將四種真菌毒素完全抗原分別與生物素偶聯(lián)，最后使用鏈霉親和素-藻紅蛋白作為信號報告蛋白，建立了直接競爭多重液相芯片檢測方法。結(jié)果表明，該方法對ZEN、FB1、嘔吐毒素和黃曲

9、霉毒素B1的檢測限分別為0.51、6.0、4.3和0.56 ng/mL。對于加標樣品的檢測，回收率達92.3％-115.5％，與用LC-MS/MS的檢測結(jié)果具有顯著相關(guān)性，表明該方法具有很好的應(yīng)用前景。
　　本論文利用制備的單克隆抗體，分別建立了競爭ELISA法、雙重定性膠體金免疫試紙條檢測法、雙重定量膠體金免疫試紙條檢測法、電化學免疫法、化學發(fā)光免疫法和液相芯片多重檢測法，在確保檢測方法特異的前提下，優(yōu)化了檢測過程中的核心參數(shù)，