羅格列酮人工抗原的合成和單克隆抗體制備研究.pdf

1、在當(dāng)前營養(yǎng)保健食品熱中,各種營養(yǎng)素及其它營養(yǎng)成分濫加、亂加的現(xiàn)象比較嚴(yán)重。羅格列酮(Rosiglitazone)屬噻唑烷二酮類抗糖尿病藥,通過提高胰島素的敏感性而有效地控制血糖。調(diào)節(jié)胰島素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄,控制血糖的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用,糾正糖及脂質(zhì)代謝異常,降低空腹及餐后血糖,改善高葡萄糖毒性。由于它的功效作用,近年來被添加到減肥類與降糖類保健食品中。建立藥物的免疫分析技術(shù)首先要獲得特異性的抗體,本文開展了羅格列酮免疫分析技術(shù)研究。主要內(nèi)容

2、研究結(jié)果如下:
　　 1.羅格列酮本身沒有免疫原性,必須將其載體蛋白偶聯(lián)后,才能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體。本文研究制備了羅格列酮的半抗原,通過質(zhì)譜進(jìn)行了鑒定。
　　 2.用活潑酯法將羅格列酮與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)合成免疫原與包被原;經(jīng)紫外光譜分析,人工抗原羅格列酮半抗原-BSA、羅格列酮半抗原-OVA與載體BSA、OVA及半抗原的紫外光譜圖相比均發(fā)生明顯變化,兩種人工抗原最大吸收峰的位置向遠(yuǎn)紫外

3、區(qū)偏移,表明人工抗原合成成功。BCA試劑盒法測得羅格列酮半抗原-BSA濃度為4.668mg/ml,而羅格列酮半抗原-OVA濃度為3.312 mg/ml;并測定出羅格列酮半抗原-BSA、羅格列酮半抗原-OVA兩種人工抗原的偶聯(lián)比分別為14:1、8.2:1。上述所有合成的人工抗原經(jīng)分裝后-20℃保存。
　　 3.用免疫抗原(羅格列酮半抗原-BSA)免疫Balb/C小鼠S1,獲得羅格列酮鼠多抗血清,其最佳包被抗原濃度為稀釋10000倍

4、;最佳抗體稀釋度10000倍;理想二抗稀釋倍數(shù)為1:10000。同時取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/O骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。細(xì)胞亞克隆、篩選后得到兩株能夠穩(wěn)定分泌抗羅格列酮單克隆抗體的細(xì)胞株,分別命名為ED3和CC4。
　　 4.本文中同時進(jìn)行了兔多抗的制備,同時優(yōu)化了間接競爭ELISA的反應(yīng)條件,其中羅格列酮半抗原-OVA為最佳包被原;最佳一抗稀釋液為Y液,最佳包被抗原稀釋倍數(shù)為1/20000,最佳抗體稀釋度1/20000,最佳二抗

5、稀釋度1/10000,最佳一抗競爭時間為50 min,最佳二抗反應(yīng)時間為45min。
　　 5.繪制了羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立羅格列酬間接競爭ELISA檢測方法,檢測限為2.18 ng/mL,檢測范圍為6.07-200.11 ng/mL。發(fā)現(xiàn)在鼠多抗和兔多抗這兩者之間,兔多抗的檢測限值更低,效價更高。
　　 本論文為保健食品中違法藥物的快速檢測試劑盒開發(fā)奠定基礎(chǔ),并為保健食品樣品前處理提供依據(jù)。在保健食品熱的今天,保健食品