伊維菌素人工抗原的合成及其單克隆抗體的制備.pdf

1、伊維菌素(ivermectin，IVM)是來自放線菌屬的阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種半合成的大環(huán)內(nèi)酯類多組分的抗生素，是一種抗寄生蟲藥物。IVM在線蟲及節(jié)肢動(dòng)物方面具有高效、廣譜殺蟲等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上，并且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也是一種廣泛使用的殺蟲劑，在醫(yī)學(xué)臨床上還可治療人類的皮膚病。雖然伊維菌素的用劑量比較小，但是IVM在動(dòng)物源性食品中的殘留可能會(huì)對人及環(huán)境產(chǎn)生潛在的危害，并且在國際競爭中會(huì)影響我國農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的出口。我國農(nóng)業(yè)

2、部規(guī)規(guī)定了可食用哺乳動(dòng)物肌肉組織中伊維菌素的最高殘留限量為10μg/kg。因?yàn)閯┝啃?，所以對于IVM殘留的檢測非常困難。
　　近些年來，人們密切關(guān)注IVM藥物的殘留對人類的危害性以及對環(huán)境存在的潛在的風(fēng)險(xiǎn)。目前用于IVM殘留檢測方法主要是高效液相色譜法，但其存在操作過程復(fù)雜、耗時(shí)、檢測成本高、儀器昂貴等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中不能廣泛的推廣使用。因此，開發(fā)研究一種科學(xué)、快速、簡單、高效的檢測方法是很必要的，對于現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析具有重要

3、的意義。本試驗(yàn)是在人工完全抗原的制備和鑒定的基礎(chǔ)上，擬制備高效價(jià)的多克隆抗體，進(jìn)一步篩選特異性強(qiáng)的單克隆抗體，為建立動(dòng)物源性食品中伊維菌素的殘留免疫學(xué)快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)主要的研究結(jié)果有以下內(nèi)容：
　　1、本試驗(yàn)依據(jù)伊維菌素的分子結(jié)構(gòu)式，選擇C4-OH、C5-OH進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，利用琥珀酸酐引入活性基團(tuán)羧基，然后再利用 NHS法合成人工抗原IVM-BSA和IVM-OVA。用紫外分光度法和SDS-PAGE對偶聯(lián)物進(jìn)行定性判斷，

4、試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致；用紫外分光光度法對偶聯(lián)物IVM-BSA和IVM-OVA進(jìn)行定量判斷，其偶聯(lián)比分別為14.1:1和14.7:1。
　　2、用偶聯(lián)物IVM-BSA作為免疫原，免疫小鼠，免疫動(dòng)物后產(chǎn)生抗 IVM的多克隆抗體，采用間接 ELISA法測定效價(jià),并且利用間接競爭ELISA法測小鼠的敏感性，之后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：效價(jià)可達(dá)到1:12800，部分甚至達(dá)到1:25600，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.2854x+0.7236

5、，R2=0.9516，通過計(jì)算得出 IC50為6.07μg/mL，再次證明了成功制備了IVM的人工抗原，并且具有一定的免疫原性能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
　　3、本次試驗(yàn)選用1號(hào)小鼠的脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，細(xì)胞融合之后，采用間接ELISA和間接競爭ELISA法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，本次試驗(yàn)篩選出一株陽性雜交瘤細(xì)胞3F7，經(jīng)三次亞克隆之后對其擴(kuò)大培養(yǎng)，采用間接 ELISA法測定抗IVM單克隆抗體的效價(jià)，其中細(xì)胞上清的效價(jià)可以達(dá)到1:12