抗豬支原體共同抗原單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)168菌株F332經(jīng)熱滅活后以提純的膜蛋白作為抗原,再與等量弗氏完全佐劑充分混合制成免疫原,腹腔注射免疫8周齡BALB/c小鼠,250μg/只;三周后,尾靜脈注射相同劑量不加佐劑的抗原,三天后,取免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag-14進(jìn)行融合.以間接ELISA和直接凝集試驗(yàn)反復(fù)篩選陽性克隆,并經(jīng)有限稀釋法三次亞克隆之后,共獲得兩株能穩(wěn)定分泌特異單克隆抗體的

2、雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為3-1G2和3-8B2.對(duì)單克隆抗體的特性鑒定結(jié)果表明,腹水單抗的間接ELISA效價(jià)分別為5×10<'13>和5×10<'11>;直接凝集效價(jià)分別為1:400和1:320.兩株單抗的免疫球蛋白亞類均為IgG<,1>,競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)測(cè)得兩株單抗的親和常數(shù)分別為40μg/mL和54μg/mL.在Dot-ELISA試驗(yàn)中兩株單抗與Mhp和豬鼻支原體(M.hyorhinis,Mh)等反應(yīng),而不與雞支原體、對(duì)照血清等反

3、應(yīng).這些結(jié)果表明兩株單抗可能是針對(duì)豬支原體共同抗原的單抗.為了鑒定出單抗識(shí)別的這類共同抗原,首先以SDS-PAGE電泳分析豬支原體的膜蛋白成分,結(jié)果顯示,Mhp168菌株F332、Mhp168菌株F99、Mhp國際標(biāo)準(zhǔn)株(J株)和Mh均有15~20條左右蛋白條帶,其分子量在14~120Kd之間.高分子量的蛋白條帶很淡,主要以中分子量和低分子量的為主,Mhp和Mh中均以80Kd和30Kd的蛋白條帶最濃,Mhp168菌株F332在31~34

4、Kd之間的蛋白條帶比Mhp168菌株F99、Mhp國際標(biāo)準(zhǔn)株(J株)和Mh的多一些.其次以Western-blot分析,結(jié)果表明兔抗Mhp、Mh、豬絮狀支原體(M.flocculare,Mf)和萊氏無膽甾原體(A.laidlawii,Al)高兔血清與豬支原體的80Kd和30Kd蛋白條帶反應(yīng),證實(shí)了豬支原體的共同抗原是80Kd和30Kd蛋白.進(jìn)一步研究顯示,單抗3-1G2和3-8B2均與Mhp和Mh的30Kd蛋白條帶反應(yīng),而不與培養(yǎng)基中的