抗大豆抗原蛋白β-conglycinin單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、本研究以半抗原為免疫原，成功制備了特異性的抗大豆β-conglycinin單克隆抗體，并在定量檢測、親和層析和體外小腸上皮細(xì)胞結(jié)合試驗中進行了初步應(yīng)用。研究共包括四個試驗。試驗1，以人工合成的對應(yīng)于β-conglycinin分子山α’亞基上的一段抗原表位肽(RPQHPER，78-84α’)作為半抗原，然后與載體蛋白(牛血清白蛋白，OVA)交聯(lián)后作為免疫原制備了抗β-conglycinin單克隆抗體(Mab 6G<,4>)。經(jīng)競爭性、非競

2、爭性酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和Western Blotting等方法鑒定，結(jié)果表明：Mab 6G<,4>屬于IgG<,1>類型抗體：該抗體能與β-conglycinin特異性結(jié)合，親和常數(shù)達(dá)6.9×10<'9>L/mol，但與其結(jié)構(gòu)或功能類似物glycinin無明顯的交叉反應(yīng)：抗體能識別β-conglycinin分子中的α和α’亞基。由此可知，制備的Mab 6G<,4>為大豆制品中β-conglycinin的定量檢測，為探討β-co

3、nglycinin在仔豬消化道內(nèi)的分布及其致敏機理提供了一個潛在的分析工具。試驗2，以單克隆抗體(Mab 6G<,4>)為工具，建立了定量檢測大豆制品中β-conglycinin的競爭性ELISA方法。結(jié)果表明，根據(jù)Mab 6G<,4>的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，抑制抗原與抗體結(jié)合50％時β-conglycinin的濃度(IC<,50>)為4.7 ng/mL,檢測限為2.0 ng/mL；經(jīng)精密度和回收率分析，Mab 6G<,4>-ELISA方法表現(xiàn)

4、出較好的靈敏度、精密度和可重復(fù)性。因此，建立的Mab 6G<,4>-ELISA方法為β-conglycinin的定量檢測提供了一個有效工具。試驗3，將單克隆抗體Mab 6G<,4>與CNBr活化的Sepharose 4B瓊脂糖凝膠偶聯(lián)后制備免疫親和柱，用親和層析的方法分離純化大豆中的β-conglycinin。結(jié)果表明，該免疫親和層析法能有效提取大豆中的β-conglycinin，其純度達(dá)92.9％。高純度β-conglycinin的獲

5、得為在后續(xù)研究中揭示單個β-conglycinin分子的抗?fàn)I養(yǎng)作用和致敏機理奠定了基礎(chǔ)。試驗4，以單克隆抗體F(ab’)<,2>片段為工具，應(yīng)用間接免疫熒光染色法分析了大豆β-conglycinin在7日齡仔豬十二指腸、空腸和回腸上皮細(xì)胞上的結(jié)合情況，并檢驗Mab 6G<,4>的應(yīng)用效果。結(jié)果表明，大豆β-conglycinin能廣泛結(jié)合于仔豬十二指腸、空腸和回腸上皮細(xì)胞，并證實了所制備的單抗Mab 6G<,4>可應(yīng)用于細(xì)胞定位分析和體