小鼠甲胎蛋白單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)和死亡患者均占全球總數(shù)的一半以上。根據(jù)全國腫瘤登記中心最新公布的2015年《腫瘤登記年報(bào)》數(shù)據(jù)，我國肝癌新增病例為46.61萬，占所有惡性腫瘤的第4位(10.86％)，而死亡病例為42.21萬，占所有癌癥死亡的第3位(15.00％)，僅次于肺癌和胃癌。盡管近年來肝癌的診斷和治療有了一定的進(jìn)展，其預(yù)后仍然不理想，五年生存率極低。究其原因，大部分肝癌患者往往在疾病的晚期才被診斷出來，有些甚至發(fā)生了

2、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，因而錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī);此外，目前幾乎沒有針對(duì)中晚期肝癌有效的治療手段。在這種情況下，迫切需要開發(fā)肝癌早期診斷試劑及新型靶向藥物，提高治療效率。
　　甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是一種分泌型的糖蛋白，通常特異性地在胚胎發(fā)育過程中的肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，而在健康成體的肝細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)。AFP是目前臨床上應(yīng)用最廣的原發(fā)性肝癌腫瘤標(biāo)記物，血清中AFP水平常用于肝癌的普查、早期診斷、術(shù)后監(jiān)測(cè)和隨訪。盡

3、管AFP對(duì)肝癌病人的診斷靈敏度僅約60％，但它仍然是目前為止最為理想的原發(fā)性肝癌診斷的臨床指標(biāo)。目前研究者們正在致力于開發(fā)新的原發(fā)性肝癌輔助診斷標(biāo)記物，以期聯(lián)合AFP提高原發(fā)性肝癌的診斷靈敏度。此外，針對(duì)AFP蛋白的表位疫苗也在化學(xué)誘導(dǎo)的肝癌模型中被證實(shí)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)AFP的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。AFP抗原也被逐漸認(rèn)為是肝癌免疫治療的潛在治療靶標(biāo)。
　　原發(fā)性肝癌動(dòng)物模型是評(píng)估肝癌靶向藥物臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值的理想模型。原

4、發(fā)性肝癌模型的特點(diǎn)是其發(fā)生過程類似于人肝癌發(fā)生的惡性轉(zhuǎn)化過程，具備正常的免疫系統(tǒng)，在研究肝癌進(jìn)程的不同階段的病理變化特點(diǎn)和療效評(píng)估具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前原發(fā)性肝癌小鼠模型建模周期長(zhǎng)（8個(gè)月以上），迫切需要發(fā)展短期建模的小鼠肝癌模型。更重要的是，目前急缺原發(fā)性鼠肝癌篩查、診斷及療效評(píng)估的有效檢測(cè)方法，鼠AFP作為小鼠肝癌的最特異的腫瘤標(biāo)記物，針對(duì)小鼠AFP建立檢測(cè)方法具有熏要的研究?jī)r(jià)值。
　　本研究旨在獲得具有診斷價(jià)值的抗小鼠AFP單

5、克隆抗體，并在原發(fā)性小鼠肝癌模型中初步探索AFP單克隆抗體應(yīng)用于肝癌檢測(cè)、診斷和治療的可行性。我們利用Gibson裝配技術(shù)獲得mAFP重組質(zhì)粒后，體外重組表達(dá)和純化帶His標(biāo)簽的mAFP蛋白，并以此作為免疫原和篩選靶標(biāo)，分別在Balb/c小鼠和LOU大鼠中篩選能特異性結(jié)合mAFP的單克隆抗體。本研究共制備12株穩(wěn)定分泌小鼠抗mAFP和8株穩(wěn)定分泌大鼠抗mAFP的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，通過間接化學(xué)發(fā)光法、原位蛋白雜交法和蛋白質(zhì)免疫印跡法

6、評(píng)估這些抗體與鼠源重組蛋白的反應(yīng)性，同時(shí)采用間接免疫熒光法或蛋白質(zhì)免疫印跡法分析這些抗體與穩(wěn)定表達(dá)小鼠AFP的細(xì)胞株和小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6的反應(yīng)性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠抗mAFP抗體中6B8和10H3能同時(shí)與線性和構(gòu)象的mAFP蛋白反應(yīng)，而小鼠抗mAFP抗體中僅9G8能與線性的mAFP蛋白反應(yīng)。我們也建立了基于CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)的原發(fā)性肝癌小鼠模型，小鼠在尾靜脈高壓注射p53/Pten打靶質(zhì)粒4個(gè)月后即可發(fā)展成為肝