牛單核細(xì)胞趨化蛋白1單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趨化因子CC亞家族的一員。MCP-1主要趨化單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，使各種炎性細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞向病變部位聚集，從而在機(jī)體防御、慢性炎癥及抗腫瘤等方面起重要作用。血液中的單核細(xì)胞在特異的趨化因子作用下，發(fā)生遷移并聚集在不同病變組織中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，如吞噬和殺傷病原微生物，遞呈抗原及分泌多種生物活性物質(zhì)等。本研究克隆表達(dá)了牛MCP-

2、1基因并制備了牛MCP-1單克隆抗體，為MCP-1在治療炎癥疾病、免疫診斷研究中提供了重要的生物材料。
　　1.牛MCP-1基因的克隆及表達(dá)
　　用ConA刺激健康荷斯坦奶牛外周血淋巴細(xì)胞，并提取細(xì)胞總RNA，以RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板成功擴(kuò)增到所需不含信號(hào)肽(BoMCP-1)和含信號(hào)肽(BoPreMCP-1)目的基因，同時(shí)還擴(kuò)增了GFP-BoPreMCP-1基因。將BoMCP-1基因分別與表達(dá)載

3、體pET-30a(+)和pGEX-6p-1相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將BoPreMCP-1基因與載體pVAX1相連構(gòu)建重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切以及測(cè)序鑒定，鑒定結(jié)果通過(guò)DNA star軟件分析均正確，無(wú)任何突變。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別命名為pET-30a-BoMCP-1、pGEX-6p-1-BoMCP-1、pVAX1-BoPreMCP-1和pVAX1-GFP-BoPreMCP-1。將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌后，經(jīng)0.5 mM/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

4、后進(jìn)行SDS-PAGE分析，出現(xiàn)預(yù)期的目的條帶，條帶大小分別為17 kDa和36 kDa左右。通過(guò)免疫親和層析法進(jìn)行蛋白的純化，Western blot結(jié)果顯示純化蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，說(shuō)明重組蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1均成功獲得表達(dá)。
　　2.牛MCP-1單克隆抗體的制備與初步應(yīng)用
　　將純化得到的重組蛋白rHis-BoMCP-1免疫6周齡BALB/c小鼠，經(jīng)3次免疫后，運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技

5、術(shù)融合細(xì)胞，以純化重組蛋白rGST-BoMCP-1為檢測(cè)原，運(yùn)用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)3次亞克隆后，共獲得3株能穩(wěn)定分泌特異性BoMCP-1單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3D10、4G9和6F5。亞型鑒定結(jié)果顯示3D10和4G9單抗為IgA亞型，6F5為IgG1亞型。間接ELISA測(cè)定效價(jià)結(jié)果顯示6F5單抗上清效價(jià)為3200，3D10和4G9上清效價(jià)均為12800;制備上述三株單抗腹水，間接ELISA測(cè)定其效價(jià)，除了6F5

6、的腹水效價(jià)較低為32000，3D10和4G9腹水效價(jià)分別為256000和512000。間接ELISA還顯示除6F5單抗與畢赤酵母表達(dá)的商品化牛MCP-1的反應(yīng)性一般，3D10和4G9單抗與畢赤酵母表達(dá)的商品化牛MCP-1的反應(yīng)性較好。Western blot結(jié)果顯示所獲得的3株單抗均與融合蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1發(fā)生反應(yīng)。構(gòu)建成功的pVAX1-GFP-BoPreMCP-1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，間接免疫熒光分析

7、單抗與MCP-1蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果顯示3株單抗均與真核表達(dá)的GFP-BoPreMCP-1有很好的反應(yīng)性。
　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合胞內(nèi)染色技術(shù)分析單抗與天然牛MCP-1蛋白的反應(yīng)性，首先對(duì)3株抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)方法的篩選優(yōu)化:①選擇兩種不同的細(xì)胞的刺激劑ConA和LPS;②設(shè)置不同的抗體濃度，從而得到比較穩(wěn)定的流式結(jié)果。結(jié)果顯示只有4G9與天然BoMCP-1有較好的反應(yīng)性。將4G9抗體應(yīng)用于牛結(jié)核病的診斷，建立基于特異性抗原的流式細(xì)