單核細(xì)胞增生性李斯特菌單克隆抗體、多克隆抗體及單域重鏈抗體的制備.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(簡稱單增李斯特菌,Listeria monocytogenes, LM)是一種常見的食源性致病菌,屬于李斯特屬(Listeria),是該屬中唯一能引起人患病的病原菌。該菌對環(huán)境的適應(yīng)性極強(qiáng),可在低溫、強(qiáng)酸、高鹽等極端條件下生存和繁殖。同時(shí),LM還能夠穿越機(jī)體的多重屏障,引起嚴(yán)重的感染性疾病,如腦膜炎、敗血癥及流產(chǎn)等,感染后致死率高達(dá)20％-30%。近年來,歐美地區(qū)不斷爆發(fā) LM的感染事件,造成了巨大的財(cái)產(chǎn)損失和人

2、員傷亡。鑒于LM的高危害性,在食品安全檢測的相關(guān)項(xiàng)目中 LM被列為必檢項(xiàng)目。因此,建立準(zhǔn)確、高效且適用于食品行業(yè)的快速檢測方法,具有迫切的現(xiàn)實(shí)需求和廣闊的應(yīng)用前景。
　　本文首先以熱滅活的 LM菌體為抗原免疫 BALB/c小鼠,成功篩選獲得了6株能穩(wěn)定分泌抗-LM單抗的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為3F2-A8、8C8-B11、10A11-A4、10E7-H6、11B9-F4、12A6-H11。6株單抗的效價(jià)分別為1:320000、1:

3、640000、1:640000、1:640000、1:640000、1:25600。Dot-blot結(jié)果表明,6株單抗與李斯特屬內(nèi)菌及部分屬外菌存在不同程度的交叉反應(yīng)。Western-blot結(jié)果表明,3F2-A8、8C8-B11、10A11-A4、10E7-H6、11B9-F4的對應(yīng)抗原為磷壁酸類物質(zhì)。
　　針對采用菌體免疫制備抗體特異性較差的現(xiàn)狀,本文通過構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-actA、pET-22b-InlB、pET-22b

4、-iap進(jìn)行原核表達(dá),并以純化的 InlB和 P60為抗原免疫 BALB/c小鼠以制備高特異性的抗體。Dot-blot結(jié)果表明,抗-InlB多抗能特異性識別 LM,與李斯特6種屬內(nèi)菌無交叉反應(yīng);抗-P60多抗與 LM ATCC13932、CMCC54001及其余50株 LM食品分離株均有反應(yīng),同時(shí)也與李斯特屬內(nèi)菌-綿羊李斯特菌 NCTC11288、英諾克李斯特菌 ATCC19119、威爾李斯特菌 ATCC35897存在交叉反應(yīng)。上述結(jié)果

5、表明,原核表達(dá)的 InlB和 P60可用于制備特異性強(qiáng)及親和力高的李斯特菌單抗。
　　此外,本文進(jìn)一步以駝源天然噬菌體展示抗體庫淘選了針對 LM的特異性單域重鏈抗體。以熱滅活的 LM菌體為抗原,通過4輪常規(guī)淘選和1輪消減淘選。采用 phage-ELISA法,對后4輪淘選洗脫物中隨機(jī)挑選的384個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行了鑒定,其中陽性克隆112個(gè)。經(jīng)序列比對、分類及統(tǒng)計(jì),從中挑取10個(gè)親和力較高的克隆進(jìn)行特異性分析。結(jié)果顯示淘選獲得了2株能

6、特異性識別LM的單域重鏈抗體,編號為 L5-78和 L5-79。構(gòu)建了 pET-25b-L5-78和pET-25b-L5-79的表達(dá)載體,經(jīng)大腸桿菌 BL21表達(dá)純化獲得單域重鏈抗體。性能分析結(jié)果顯示2株抗體均可在極端 pH、高變性劑及高溫下保持較高的活性,具有良好的穩(wěn)定性。以4A7單抗及 L5-79單域重鏈抗體建立了雙抗夾心 ELISA法,LM檢測限為5×106 CFU/mL。
　　總之,本研究通過3種方法制備針對 LM的抗體,