蓖麻毒素單克隆抗體制備、檢測(cè)方法及單鏈抗體研究.pdf

1、蓖麻毒素(Ricin Toxin，RT)來(lái)自大戟科植物蓖麻(Ricinus communis)種子，屬糖蛋白，含量約占種子的1-3％。RT分子量約為64kDa，由A鏈(RTA)和B鏈(RTB)通過(guò)二硫鍵連接，其中RTA為效應(yīng)鏈，RTB為結(jié)合鏈。RTA由267個(gè)氨基酸組成，分子量約為32kDa?；钚员Ｊ匚稽c(diǎn)Glu177和Arg180位于催化活性中心，它們對(duì)RTA的酶活性至關(guān)重要。RTB由256個(gè)氨基酸組成，分子量約為34kDa，其上兩條寡

2、糖鏈(GlcNAc)2(Man)8和(GlcNAc)2(Man)7分別接在第95位和第135位Asn殘基上，如果除去這兩條寡糖鏈，可導(dǎo)致RTB的凝集素活性丟失。
　　 蓖麻毒素是一種目前沒(méi)有疫苗或特殊對(duì)抗措施的與生物恐怖有關(guān)的蛋白毒素。由于毒性強(qiáng)，來(lái)源相對(duì)較廣泛，已被列為潛在的重要毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。另外，蓖麻毒素還具有明顯的抗腫瘤作用，利用蓖麻毒素與抗腫瘤的特異McAb結(jié)合，制備的免疫毒素，在惡性腫瘤的治療上具有很好的應(yīng)用前

3、景。因此，開(kāi)展蓖麻毒素的研究不僅有重要的軍事意義，也有很大的臨床醫(yī)療價(jià)值。
　　 本研究從提取純度較高的蓖麻毒素、制備抗蓖麻毒素單克隆抗體、建立蓖麻毒素的GICA、HPLC、SPR檢測(cè)方法、到構(gòu)建重組抗蓖麻毒素的ScFv原核表達(dá)載體等，進(jìn)行了一系列的有益探索。主要結(jié)果如下：
　　 (1)采用Sepharose4B柱吸附蓖麻毒素和蓖麻凝集素，用半乳糖洗脫，經(jīng)Sephacryl S-200分子篩層析，將蓖麻毒素和蓖麻凝集素分

4、開(kāi)。SDS-PAGE電泳鑒定，BioCaptMw軟件分析，證明我們提取到的RT相對(duì)分子量約為60 kDa，RTA約為32kDa，RTB約為34kDa。昆明鼠尾靜脈注射RT，改良寇氏法計(jì)算攻毒后小鼠LD5，48h的LD50為1.20±0.26 ug/kg，72h的LDso為0.71士0.15ug/kg。MTT法測(cè)定RT作用12h后，對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的半抑制濃度，IC50=9.39ng/mL，對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW246.7細(xì)胞的半抑

5、制濃度，IC50=35.27ng/mL。作用24h后，對(duì)以上兩種細(xì)胞的ICso在0.05-0.01ng/mL之間。薄層等電聚焦電泳測(cè)定RT等電點(diǎn)pI為7.10。
　　 (2)篩選到抗RT的McAb6株，分別命名為1H4、4D8、4D12、1C、2F、3A。6株單抗腹水抗體效價(jià)分別為：3.7×105、1.19×107、4.5×106、3.2×106、5.7×106、2.6×106;間接ELISA法鑒定：1H4、4D8、4D12、1

6、C、2F、3A皆屬I(mǎi)gG1亞類；抗原表位分析表明：1H4、4D8、4D12單抗的抗原位點(diǎn)位于蓖麻毒素A鏈上，1C、3A單抗的抗原位點(diǎn)位于蓖麻毒素B鏈上，2F單抗則在蓖麻毒素A、B鏈上均有其抗原位點(diǎn)；1C、1H4、2F、3A、4D8、4D12等McAb與蓖麻毒素的親和常數(shù)與解離常數(shù)分別為：1C的KA=1.86×1010M-1、KD=5.38×10-11M;1H4的KA=2.29×108Ml-1、KD=4.36×10-9M;2F的KA=4.

7、1×108M-1、KD=2.44×10-9M;3A的KA=1.93×1010M-1、KD=5.18×10M-1;4D8的KA=3.40×1013M-1、KD=2.94×10-14M;4D12的KA=I.81×1011M-1、KD=5.53×10-12M。
　　 (3)采用兩株抗RT不同抗原位點(diǎn)的單克隆抗體，一株作為捕獲抗體，一株作為金標(biāo)抗體，對(duì)利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)RT進(jìn)行了探索。制備了40nm膠體金，標(biāo)記了單抗；優(yōu)化了試紙

8、條的工藝條件，組裝了試紙條；用試紙條檢測(cè)了標(biāo)準(zhǔn)毒素和模擬樣本，結(jié)果表明試紙條最低檢測(cè)限為10ug/mL左右，檢測(cè)時(shí)間5-10min;對(duì)試紙條的特異性、穩(wěn)定性等進(jìn)行了初步研究。
　　 (4)選用昭和公司PROTEIN KW-802.5凝膠色譜柱(8x300mm)，以0.3M氯化鈉0.05M磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)為流動(dòng)相，以280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，建立了RT的HPLC檢測(cè)方法：Ricin在0.093～5.97ug范圍內(nèi)呈良好的線

9、性關(guān)系，回歸方程為Y=0.0116X+34.63，R2=l，其標(biāo)準(zhǔn)回收率為102.39%5.06%，變異系數(shù)為4.94%；水中濃縮和未濃縮Ricin加樣回收率分別為101.10%士1.16%和93.04%士1.23%，變異系數(shù)分別為1.15%和1.32%；經(jīng)純化后水樣和香腸樣品中的Ricin的加樣平均回收率分別為94.32+0.74%和80.99士1.66%，變異系數(shù)分別為0.78%和2.05%；該法檢測(cè)RT的最低檢測(cè)限是23.33ng

10、。
　　 (5)建立了SPR檢測(cè)蓖麻毒素的方法，在0-2000ng/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9887，最低檢出濃度為0.05ng/mL。建立了SPR檢測(cè)相思子毒素的方法，在250-2000ng/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9886，最低檢出濃度為0.5ng/mL。對(duì)兩種毒素的混合物同時(shí)檢測(cè)時(shí)，同單獨(dú)檢測(cè)的效果一樣。
　　 (6)利用基因工程抗體技術(shù)，構(gòu)建重組ScFv原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，并探討其生物活性

11、：用RT-PCR的方法從分泌抗蓖麻毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4D12中，克隆出抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，并測(cè)定了其核苷酸序列；用(Gly4Ser)3Linker基因?qū)L、VH拼接成ScFv基因形式，測(cè)序結(jié)果表明，基因全長(zhǎng)750bp，Vr、Linker、VH拼接正確；用pMAL-p2X表達(dá)載體對(duì)ScFv基因進(jìn)行了可溶性表達(dá)，經(jīng)Amylose直鏈淀粉親和層析柱純化，得到了抗RT ScFv;ELISA及SPR技術(shù)測(cè)定ScFv活性，結(jié)果表明