重組蛋白Cfr的單克隆抗體制備及初步應(yīng)用.pdf

1、Cfr蛋白是由cfr基因編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶，它能與多種藥物作用的靶點(diǎn)結(jié)合從而介導(dǎo)五類藥物耐藥。在不同國家、地區(qū)的人源和動物源細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)了cfr基因，其攜帶率有逐年增加的趨勢，它的出現(xiàn)和流行給臨床醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)帶來了潛在的危害，引起了人們的高度關(guān)注。目前cfr基因陽性菌的監(jiān)測方法主要是普通PCR法，但監(jiān)測的結(jié)果只能表明該細(xì)菌是否含有cfr基因，而無法確定cfr基因是否表達(dá)了Cfr蛋白，無法進(jìn)一步為合理用藥和風(fēng)險評估提供依據(jù)。因此，從免疫

2、學(xué)方面探索建立對Cfr蛋白的監(jiān)測方法就顯得十分重要。通過制備重組蛋白Cfr的單克隆抗體;再以制得的單抗為一抗，用Western blot方法對臨床腸球菌進(jìn)行檢測，達(dá)到為建立監(jiān)測cfr基因陽性菌的免疫學(xué)方法提供理論依據(jù)的目的。
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的純化的重組蛋白Cfr為免疫原，對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。初次免疫時將弗氏完全佐劑與抗原60μg（50μg-100μg均可）進(jìn)行等體積混合，充分乳化后，再皮內(nèi)分點(diǎn)注射;一個月后對小鼠進(jìn)

3、行加強(qiáng)免疫，其抗原量、注射體積均不變，但改為用弗氏不完全佐劑和皮下注射的方式;此后每間隔兩周加強(qiáng)免疫一次，四免后分離小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，并用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞）;以純化的重組Cfr蛋白為包被原，用間接ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，將選出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng);經(jīng)過三次及以上亞克隆后成功獲得了1株能夠穩(wěn)定分泌針對重組蛋白Cfr的高效價單抗的雜交瘤細(xì)胞克隆(Cfr-D9

4、)。通過檢測發(fā)現(xiàn)這株單抗能特異性的結(jié)合重組蛋白Cfr，并且有較高的效價（腹水效價1∶243000）。亞類鑒定結(jié)果表明這株單抗的亞類為IgG2a。
　　以制備的單抗為一抗，用Western blot的方法對16株臨床陽性腸球菌和5株臨床陰性腸球菌進(jìn)行分析。結(jié)果表明，制備的單抗能特異性的識別臨床陽性腸球菌菌株中的Cfr蛋白;還發(fā)現(xiàn)在用等蛋白量進(jìn)行檢測的情況下，16株陽性腸球菌的著色帶有粗有細(xì)，推測臨床陽性腸球菌菌株在同樣的表達(dá)條件下，

5、細(xì)菌所表達(dá)的Cfr蛋白量有差異。另外，還發(fā)現(xiàn)陽性腸球菌菌株所表達(dá)的Cfr蛋白量與菌株的不同地區(qū)來源、不同的分離部位、不同的克隆型沒有直接的關(guān)系。但目前還沒有從分子機(jī)理方面對上述情況進(jìn)行研究。
　　綜上所述，成功制備了單克隆抗體;并以該單抗為一抗，用Western blot方法成功對21株臨床腸球菌菌株進(jìn)行了檢測，證明了實(shí)驗(yàn)制得的單克隆抗體有比較好的特異性。實(shí)驗(yàn)初步建立了用Western blot方法來檢測臨床菌株表達(dá)的Cfr蛋白，