非洲豬瘟病毒p30重組蛋白的表達(dá)及單克隆抗體制備.pdf

1、非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種高度致死性傳染病，強(qiáng)毒株感染的死亡率高達(dá)100％。該病一直在許多非洲國(guó)家流行，近年來(lái)流行范圍有擴(kuò)大趨勢(shì)，已傳播到格魯齊亞、俄羅斯等鄰國(guó)，使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大威脅。ASFV能以軟蜱和非洲野豬作為儲(chǔ)存宿主和傳播媒介，具有復(fù)雜的感染與免疫逃避機(jī)制，目前無(wú)任何疫苗用于防疫，因此快速、準(zhǔn)確的診斷對(duì)防止

2、該病傳入和控制具有重要意義。
　　p30是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和強(qiáng)免疫原性蛋白之一，重組p30是非常重要的ASFV診斷抗原。為了制備p30重組抗原和單克隆抗體用于ASFV診斷，本研究將E75株ASFV p30基因序列優(yōu)化成大腸桿菌密碼子偏愛(ài)序列，將人工合成的序列插入原核表達(dá)載體pET-30a，用重組載體pET-P30轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:表達(dá)的His-p30融合蛋白為預(yù)

3、期的30kD，主要以包涵體形式表達(dá)。
　　用鎳柱親和層析法從重組菌裂解物純化得高純度的His-p30融合蛋白，以純化蛋白為抗原免疫小鼠，每次免疫后采血分離血清。以重組蛋白為包被抗原，用方陣試驗(yàn)確定最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)，用建立的間接ELISA對(duì)免疫小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示4次免疫小鼠血清的抗體效價(jià)為1∶1638400;按照常規(guī)的雜交瘤制備方法，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性