肝臟F蛋白的表達及單克隆抗體的制備.pdf

1、肝臟疾病嚴重影響人類健康，并對社會經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生巨大影響。肝癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化等都是肝癌主要的致病原。因此肝病的診斷就成為醫(yī)學診斷學的重要組成部分。人類肝臟F蛋白是一種新型的尚未應用于臨床的直接反映肝損傷程度的生物學標志之一。從80年代開始，人們開始研究血清F蛋白含量與肝損傷程度的關系，獲得了一些臨床數(shù)據(jù)。肝細胞中的F蛋白濃度與血清F蛋白的濃度之間存在的巨大差異以及F蛋白的嚴格的組織特異性，使

2、其成為一種非常有希望的反映肝細胞損傷程度的靈敏和特異的指標。目前，肝臟特異性F蛋白的研究與臨床應用受到越來越多的關注。 本文在前人研究的基礎上，將F蛋白的表達質(zhì)粒pET15b-F轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)pLysS中，用IPTG誘導其表達，表達后通過親和層析柱(Ni2+-chargedIDAHis-bindcolumn)純化，用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳與免疫印跡(Westernblot)對其進行檢測。并以此蛋白為

3、抗原免疫BALB-C小鼠以獲得免疫的脾細胞，用間接ELISA法測定其血清抗體的效價，選取抗體效價高的小鼠取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，制備單克隆抗體。 人F蛋白的表達菌株BL21(DE3)pLysS表達后的全菌蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，目的條帶分子量大小約為43kD，與文獻報導一致。Western-blot顯示純化后的F蛋白與豚鼠抗人提純F蛋白多克隆抗血清反應為陽性，說明我們經(jīng)基因工程方法得到的純化的F蛋白具有免疫活性。免疫

4、BALB-C小鼠后，用ELISA法測定血清其抗體滴度高達1:72000，可用于單抗的制備；細胞融合后培養(yǎng)上清有15孔抗體陽性，抗體滴度最高為1:25600，Western-blot顯示制備的抗體與基因工程表達的人肝臟特異性F蛋白發(fā)生了反應，表明我們制備的抗體具有免疫特異性，可用于后續(xù)的單克隆抗體的大量制備和提純以及免疫試劑的開發(fā)。 肝臟特異性F蛋白是反映肝損傷的一種靈敏、有效而又穩(wěn)定的指標，同時F蛋白在肝病早期診斷與治療、藥物的

5、篩選與療效觀察、治愈狀況、肝損傷程度的判斷等方面以及法醫(yī)學方面、免疫耐受肝移植抗排斥方面的研究都具有重要的應用價值。用化學提純的方法很難得到大量F蛋白，這就阻礙了其他研究的進行。因此，本文采用基因工程方法得到人肝臟F蛋白的表達克隆，并誘導表達人肝臟F蛋白，解決了其來源問題。同時以此基因工程蛋白為抗原初步制備單克隆抗體，并通過免疫印跡法證實了此抗體的特異性，為下一步的免疫試劑最適條件的摸索、免疫耐受及其免疫學特性等研究打下基礎，為臨床肝病