人ULBP3aa30~177蛋白的表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、目的:
　　 表達(dá)和純化人ULBP3胞外段(aa30～177)融合蛋白,制備小鼠抗人ULBP3單克隆抗體,為進(jìn)一步研究人ULBP3的生物學(xué)功能及臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.人ULBP3胞外段(aa30～177)基因的克隆和原核表達(dá):采用RT-PCR方法,從人結(jié)腸癌細(xì)胞株COLO205中獲得人ULBP3胞外段(aa15～177)基因,并克隆至pMD-18T載體,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,選擇陽性

2、克隆進(jìn)行酶切鑒定和序列測定。從質(zhì)粒hULBP3胞外段(aa15～177)-pMD-18T中擴(kuò)增hULBP3胞外段(aa30～177)核酸序列,連接至表達(dá)載體pQE30上。經(jīng)過測序鑒定,將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌M15,1mmol/LIPTG、30℃,4小時誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá);將表達(dá)的蛋白用Ni2+-IMAC柱進(jìn)行純化、復(fù)性,并通過WesternBlot進(jìn)行鑒定。
　　 2.單克隆抗體的制備:人ULBP3aa30～177融合蛋白免

3、疫BALB/c小鼠,應(yīng)用雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合,并通過間接ELISA法篩選分泌小鼠抗人ULBP3抗體的雜交瘤細(xì)胞株,擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。將成功分泌抗人ULBP3aa30-177蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞注射健康BALB/c小鼠腹腔內(nèi),兩周左右產(chǎn)生腹水。腹水經(jīng)ProteinG親和層析柱進(jìn)一步純化后獲得腹水型抗體。
　　 3.單克隆抗體的鑒定:通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、Westernblot,流式細(xì)胞術(shù)和

4、對免疫組化染色對單克隆抗體進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功克隆人ULBP3aa30～177基因,其編碼區(qū)為444bp,編碼148個氨基酸殘基,與GenBank中公布的序列(NM_024518.1)完全一致。成功構(gòu)建了hULBP3aa30～177-PQE30原核表達(dá)載體,表達(dá)相對分子質(zhì)量約17kD的融合蛋白。該蛋白表達(dá)量高,復(fù)性后的hULBP3aa30～177蛋白濃度約為180pg/ml。經(jīng)免疫小鼠血清效價的測定,

5、證實該蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性。WesternBlot結(jié)果顯示所制備抗體能與原核表達(dá)蛋白hULBP3aa30-177×6His特異性結(jié)合。
　　 2.間接ELISA法檢測其抗血清效價,其效價大于1:1.0×106。雜交瘤細(xì)胞融合率為50%,經(jīng)過間接ELISA法反復(fù)篩選,陽性率為16.7%,對其中2株雜交瘤細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行3次克隆化,獲得兩株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株B2-F1-F1和B4-C5-D11。兩株單克隆抗體識別不同的抗

6、原表位,其腹水效價分別為1:1.6×106(B2-F1-F1)和1:1.4×106(B4-C5-D11)。
　　 3.Westernblot結(jié)果顯示在27kD(細(xì)胞表達(dá)完整天然構(gòu)象hULBP3蛋白的分子量)左右位置有目的條帶,間接證明結(jié)合的分子是hULBP3。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示這兩株抗體分別能識別人結(jié)腸癌細(xì)胞株COLO205和結(jié)直腸癌原代細(xì)胞ULBP3分子。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示所制備的單克隆抗體也可識別結(jié)直腸癌組織標(biāo)本細(xì)胞膜

7、上ULBP3分子。驗證了所制備的B2-F1-F1和B4-C5-D11單克隆抗體可識別細(xì)胞表面的ULBP3分子。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pQE30-ULBP3aa30～177,并獲得高純度的人pQE30-ULBP3aa30～177融合蛋白;成功制備了小鼠抗人ULBP3分子的單克隆抗體。證實所制備的抗體不僅能識別人結(jié)腸癌細(xì)胞株COLO205,而且能特異地識別人臨床結(jié)直腸癌組織細(xì)胞膜表面的ULBP3分子。h