小鼠Metrnl單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用.pdf

1、肥胖及其相關(guān)的代謝疾病已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。脂肪組織過多是肥胖的主要特點(diǎn)之一，已有研究表明，脂肪組織不僅是能量儲存器官，還是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官。脂肪組織可產(chǎn)生和分泌多種脂肪因子，通過脂肪因子影響機(jī)體的代謝、胰島素敏感性、心腦血管穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)、炎癥等。因此，圍繞脂肪因子開展一系列研究，對疾病的預(yù)防及治療具有重要的意義。
　　2008年，課題組發(fā)現(xiàn)一種新的脂肪因子Metrnl。Metrnl在皮下脂肪高表達(dá)，又被稱為Subfati

2、n。迄今為止，關(guān)于Metrnl功能的研究非常有限。據(jù)報(bào)道，Metrnl可促進(jìn)白色脂肪棕色化、軸突生長、軟骨細(xì)胞分化，以及增加胰島素敏感性等。但是在進(jìn)一步研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)Metrnl缺乏相應(yīng)的抗體工具，嚴(yán)重限制了對其開展深入研究?？贵w用途廣泛，在多種檢測方法中不可或缺，如Western blot、ELISA、免疫組化、免疫共沉淀等。因此，本課題擬使用雜交瘤技術(shù)制備小鼠Metrnl單克隆抗體，進(jìn)而通過初步的篩選鑒定，以期篩選出可用于后續(xù)

3、Metrnl研究的小鼠單克隆抗體。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.小鼠Metrnl單克隆抗體的制備
　　(1)設(shè)計(jì)小鼠Metrnl多肽抗原表位，合成后將其與載體蛋白偶聯(lián)，以SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色檢測多肽抗原的偶聯(lián)情況。
　　(2)將小鼠Metrnl基因與改造的pET-28a載體偶聯(lián)，原核表達(dá)后，使用SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色檢測表達(dá)的蛋白;Western blot方法檢測蛋白攜帶的His標(biāo)簽。
　　

4、(3)以多肽和小鼠全長蛋白為抗原免疫小鼠，免疫結(jié)束后一周取血，使用ELISA方法檢測血清效價(jià)。選取效價(jià)較高的小鼠，取其脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)基上篩選雜交瘤細(xì)胞，隨后進(jìn)行兩次亞克隆。選取狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水進(jìn)行純化。
　　2.Metrnl全敲小鼠的培育及基因鑒定
　　(1)使用MetrnlloxP/loxP小鼠和Ella-Cre小鼠雜交得到帶有Ella-Cre基因的Metrn

5、l雜合子小鼠(Metrnl+/-;Ella-Cre)。為去掉Ella-Cre基因，將Metrnl+/-;Ella-Cre小鼠與C57小鼠雜交，得到Metrnl雜合子小鼠(Metrnl+/-)。最后將Metrnl+/-小鼠自交，即可得到Metrnl-/-全敲小鼠及野生對照小鼠。使用PCR方法鑒定子代基因型。
　　(2)使用Real-time PCR方法檢測Metrnl全敲小鼠mRNA表達(dá)。
　　(3)使用ELISA方法檢測Me

6、trnl全敲小鼠血清中Metrnl蛋白濃度。
　　3.小鼠Metrnl單克隆抗體的鑒定和應(yīng)用
　　(1)使用Western blot方法以重組蛋白，C57結(jié)腸組織蛋白，WT、KO結(jié)腸組織蛋白對單克隆抗體進(jìn)行鑒定。
　　(2)將不同有效的單克隆抗體應(yīng)用于免疫組化、免疫共沉淀檢測。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.本課題共設(shè)計(jì)了14條多肽抗原序列，合成后將其與載體蛋白偶聯(lián)，經(jīng)檢測其中一個(gè)偶聯(lián)失敗，其它均偶聯(lián)成功。本課題又

7、重新改造設(shè)計(jì)了一條多肽抗原并檢測成功。
　　2.小鼠Metrnl重組蛋白表達(dá)成功，且蛋白中含有His標(biāo)簽。
　　3.根據(jù)ELISA檢測免疫后小鼠血清效價(jià)的結(jié)果，選取效價(jià)較大的小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。在以小鼠Metrnl多肽抗原制備抗體的過程中選出56株陽性雜交瘤細(xì)胞，在以小鼠Metrnl蛋白制備抗體的過程中選出25株陽性雜交瘤細(xì)胞，共篩選出81株陽性雜交瘤細(xì)胞。
　　4.以小鼠Metrnl全長重組蛋白鑒定所有

8、腹水抗體。實(shí)驗(yàn)未能從56株Metrnl多肽抗原制備的抗體中篩選出有效抗體;由小鼠Metrnl全長蛋白制備的25株抗體中，有12株單克隆抗體可識別Metrnl重組蛋白。
　　5.在C57小鼠各組織Metrnl mRNA表達(dá)檢測中，結(jié)腸表達(dá)最高。
　　6.本課題成功構(gòu)建了Metrnl全身敲除小鼠，并在組織表達(dá)、血液水平上進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　7.以小鼠結(jié)腸組織蛋白為樣品鑒定12株識別重組蛋白的抗體，結(jié)果顯示抗體并不適用于組織樣

9、品Western blot檢測。
　　8.將12株識別重組蛋白的抗體應(yīng)用于免疫組化、免疫共沉淀檢測，結(jié)果顯示有不同的有效抗體。
　　綜上所述，本課題分別利用小鼠Metrnl多肽片段和全長重組蛋白免疫小鼠，共獲得81株單克隆抗體，其中，由Metrnl全長蛋白制備的25株抗體中，有12株單克隆抗體可在Western blot檢測中識別小鼠Metrnl重組蛋白，這些抗體有望在今后有關(guān)Metrnl的研究中發(fā)揮作用。在抗體的驗(yàn)證過程中