抗大豆Ⅱ號亞型鈣調(diào)素單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、植物鈣調(diào)素(CaM)的多基因家族編碼了多種鈣調(diào)素亞型，它們在生化特性、組織分布及生物學(xué)功能等方面均表現(xiàn)出了各自的特性。通過對不同亞型CaM的亞細(xì)胞定位，可以了解生物體中存在不同亞型CaM的意義，并在此基礎(chǔ)上研究不同亞型CaM在植物的生長發(fā)育過程中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。本文設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)擬制備抗大豆2號亞型CaM(SCaM-2)的單克隆抗體(mAb)并對其性質(zhì)及功能進(jìn)行研究，以期為定位研究打下基礎(chǔ)。 首先將含有pSCaM-2質(zhì)粒pET-28

2、b(+)的大腸桿菌BL21進(jìn)行培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，通過Phenyl-Sepharose4B疏水親和層析柱提取純化SCaM-2，經(jīng)SDS-PAGE證明是一條帶，可作為制備單克隆抗體的抗原材料。 用純化的SCaM-2免疫BALB/c小鼠，將免疫鼠脾細(xì)胞和小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)ELISA法多次篩選和有限稀釋再克隆化，最終建立10株穩(wěn)定分泌抗SCaM-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與各亞型SCaM

3、s的交叉反應(yīng)，從中選取3株雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠制備腹水抗體。經(jīng)檢測腹水抗體效價(jià)為10-4～10-5。用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水單克隆抗體。采用間接ELISA分析單克隆抗體特異性，結(jié)果表明三株單克隆抗體(分別命名為6F11F3、7C5E9和7E10E2)在高稀釋度時(shí)分別與SCaM-1、SCaM-2、SCaM-4、SCaM-5出現(xiàn)特異反應(yīng)：6F11F3稀釋至1：32000只識別SCaM-1、SCaM-2，7C5E9稀釋至1：64000只與S

4、CaM-4出現(xiàn)特異性反應(yīng)，7E10E2稀釋至1：32000只與SCaM-5出現(xiàn)特異性反應(yīng)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)也表明，在高稀釋度時(shí)，6F11F3識別SCaM-1、SCaM-2，而7C5E9和7E10E2分別只與SCaM-4、SCaM-5出現(xiàn)特異性反應(yīng)。通過免疫雙擴(kuò)散法，對三株單克隆抗體作Ig亞類鑒定，結(jié)果顯示6F11F3、7C5E9為IgG2a亞型，7E10E2為IgG1亞型。相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6F11F3、7C5E9可能識別SCaM-2相同的

5、抗原表位，而7E10E2可能識別不同的抗原表位。用非競爭ELISA法測定三株單克隆抗體的親和常數(shù)，結(jié)果6F11F3對SCaM-2的親和常數(shù)Ka為2.127±0.418×106M-1，7C5E9對SCaM-4的親和常數(shù)Ka為9.69±2.406×106M-1，7E10E2對SCaM-5的親和常數(shù)Ka為1.203±0.429×107M-1。結(jié)論：本課題制備的三株單克隆抗體中，6F11F3可作為識別SCaM-1、SCaM-2的抗體用于研究，7