SARS病毒S蛋白特異性單克隆抗體制備和抗原識別位點鑒定.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severeacuterespiratorysyndrome，SARS)是一種新型傳染性疾病，其病原體為SARS病毒(SARS-associatedcoronavirus，SARS-CoV)。SARS于2002年年底首先出現(xiàn)在中國廣東省，之后沿著國際航線迅速向全球傳播，在遍及五大洲的33個國家和地區(qū)引起了8,450病例和810人死亡。這次SARS全球爆發(fā)嚴(yán)重威脅了世界公共健康和社會經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定。盡管這次爆發(fā)在2003年

2、最終得到了控制，后來在臺灣、新加坡和中國大陸的實驗室由于意外事故釋放病毒引起了在這些地區(qū)的獨立的小規(guī)模爆發(fā)。2003年年底至2004年年初，中國廣東報道了新的感染病例，病人與被SARS病毒感染的動物有過接觸，而這次的病毒毒株與2002-2003期間流行的毒株有明顯不同[1]。這些事件說明SARS在將來隨時可能會發(fā)生，或者由實驗室保存的樣品引起，或者由動物宿主體內(nèi)的SARS樣病毒進(jìn)化而來的毒株引起。因此，研制SARS檢測診斷制劑、制備有效

3、和安全的疫苗以預(yù)防SARS的流行和為生物防御做準(zhǔn)備是一項目前十分緊迫的任務(wù)。 臨床研究表明，康復(fù)期SARS患者的血清抗體對治療危重的SARS患者有一定的療效。因此，研制抗SARS-CoV的抗體對于探索SARS的特異性治療具有重要意義。雖然在SARS肆虐之際，鼠源性單克隆抗體并不能解燃眉之急，但是從SARS其他相關(guān)研究和建立免疫學(xué)診斷方法角度來看，單克隆抗體的研制卻是必不可缺的。實驗室早期診斷是控制疾病的重要手段。以RT-PCR為

4、基礎(chǔ)的病毒核酸檢測法存在敏感性和特異性的問題，測定病毒特異抗體的血清學(xué)方法不能在SARS發(fā)病的早期提供診斷結(jié)果。建立基于SARS病毒特異單克隆抗體的SARS病毒抗原檢測方法，對SARS的早期診斷可能會有重要作用。 滅活SARS病毒由于其容易制備的特點可能會成為可用于臨床的第一代疫苗，但它的安全性是一個很大的問題。生產(chǎn)疫苗的工人在處理濃縮的活病毒時有被感染的危險，未被完全滅活的病毒可以在接種人群中引起SARS的爆發(fā)，而且有些病毒蛋

5、白可能會引起有害的免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致SARS樣疾病。在SARS病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中S蛋白是最大和最復(fù)雜的結(jié)構(gòu)蛋白，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，負(fù)責(zé)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合、膜融合和進(jìn)入靶細(xì)胞，是誘導(dǎo)中和性抗體的主要抗原。研究表明基于S蛋白的疫苗能夠誘導(dǎo)中和抗體和保護(hù)性免疫反應(yīng)，但是也不能排除全長S蛋白產(chǎn)生的抗體可能會增強(qiáng)不同SARS-CoV分離株的感染或介導(dǎo)有害的免疫反應(yīng)的危險。研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)FIPV的S蛋白的重組牛痘病毒疫苗會使接種動物在被野

6、生型病毒感染后出現(xiàn)抗體依賴性的疾病增強(qiáng)現(xiàn)象，對HIV-1的研究結(jié)果也表明針對HIV-1包膜糖蛋白免疫優(yōu)勢表位的抗體可以增強(qiáng)其它HIV-1分離株的感染。因此，對SARS病毒S蛋白的抗原表位進(jìn)行全面的分析和精確定位是研究該病的診斷以及疫苗分子設(shè)計等的重要基礎(chǔ)，而SARS病毒S蛋白特異單抗的獲得將為S蛋白免疫學(xué)特征研究提供有用工具。 抗體識別的蛋白質(zhì)抗原表位的確定可為免疫化學(xué)分析提供十分有用的信息。獲得SARS病毒S蛋白的重疊小片段是

7、抗體表位作圖中很重要的一個環(huán)節(jié)。由于S蛋白是由病毒感染的真核細(xì)胞表達(dá)，原核系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白不能解決翻譯后修飾加工的問題，用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白可以解決修飾的問題，但表達(dá)和純化過程比較耗時費力。酵母是真核細(xì)胞，含有與哺乳動物相似的蛋白折疊機(jī)制，比原核細(xì)胞更有可能正確的表達(dá)和呈現(xiàn)人源蛋白。將S蛋白及其片段融合表達(dá)于酵母表面，不僅更接近S蛋白在病毒表面的真實構(gòu)象，而且可以很方便的用流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)和與抗體結(jié)合的情況。 本研究選

8、擇SARS病毒S蛋白為靶抗原，擬用滅活SARS病毒、重組表達(dá)S蛋白片段和化學(xué)合成肽為免疫原制備S蛋白特異性單克隆抗體。利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件預(yù)測分析S蛋白后選擇了S424-471和S754-801兩個48肽化學(xué)合成。三種不同形式抗原免疫小鼠后，滅活SARS病毒和S蛋白片段免疫組都產(chǎn)生了很強(qiáng)的抗體反應(yīng)，但滅活SARS病毒免疫血清與合成肽和S1蛋白片段的ELISA反應(yīng)為陰性或很弱；合成肽免疫組沒有產(chǎn)生有效的抗體反應(yīng)。基于以上結(jié)果，我們選用重

9、組S1蛋白片段免疫小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選到3株S1蛋白特異單克隆抗體，分別命名為mAb1、mAb2和mAb3。 為了分析單抗的抗原結(jié)合位點，我們采用酵母表面呈現(xiàn)系統(tǒng)重組表達(dá)了針對S1蛋白的各種截斷片段，用流式細(xì)胞儀分析抗體與片段的結(jié)合情況，非?？旖莸貙?株抗體的結(jié)合位點分別定位在S337-360(mAb1)和S390-399區(qū)段(mAb2/mA3)。在確定抗體識別線性表位的基礎(chǔ)上，我們用單抗篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫，比較分析陽

10、性克隆呈現(xiàn)的12肽氨基酸序列和S蛋白氨基酸序列，結(jié)果顯示抗體mAb1篩選陽性序列與S蛋白335～346氨基酸序列有關(guān)聯(lián)，抗體mAb3/mAb2篩選陽性序列S蛋白381～399氨基酸序列特征相似。噬菌體肽庫分析結(jié)果不僅進(jìn)一步證實了用酵母表面呈現(xiàn)技術(shù)對抗體的抗原結(jié)合位點的定位，而且提供了與抗體特異性結(jié)合有關(guān)的重要信息：S蛋白的340W和341E是抗體mAb1特異結(jié)合所必需的氨基酸，而390K、391G、392D和395R是抗體mAb2/mA