抗幽門螺桿菌VacA和HpaA雙特異性單克隆抗體的制備.pdf

1、研究目的：通過細胞雜交-雜交瘤技術(shù)制備抗幽門螺桿菌細胞空泡毒素（VacA）和粘附素（HpaA）抗原的雙特異性單克隆抗體，并初步鑒定其生物學(xué)、免疫學(xué)和理化特性。為幽門螺桿菌（H.pylori）感染的防治研究、診斷試劑盒的研制及探討其致病機制奠定基礎(chǔ)。 方法：自重組幽門螺桿菌細胞空泡毒素、粘附素（pQE30-V/H-DH5α）基因工程菌提取細胞空泡毒素（VacA）和粘附素（HpaA）的重組蛋白，12％SDS-PAGE電泳鑒定，以Va

2、cA-HpaA重組蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠。取免疫BALB/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞株SP2/0，用50％聚乙二醇（PEG）融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)出雜交瘤細胞。以純化的rVacA為抗原，間接ELISA法初篩分泌抗VacA抗體的雜交瘤細胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗rVacA單抗的陽性雜交瘤細胞株。陽性雜交瘤細胞株再與血清HpaA高滴度的免疫BALB/c小鼠脾細胞用50％聚乙二醇（PEG）融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)出

3、雜交瘤細胞，分別用純化的rVacA、rHpaA為抗原，間接ELISA法篩選同時分泌抗VacA和HpaA抗體的雜交-雜交瘤細胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗rVacA和rHpaA雙特異性單克隆抗體陽性的雜交-雜交瘤細胞株。陽性細胞株體外連續(xù)傳30代、反復(fù)凍存復(fù)蘇6次、液氮中凍存1.5個月后復(fù)蘇，測定細胞株分泌的雙特異性單克隆抗體的穩(wěn)定性。做雜交-雜交瘤細胞的染色體計數(shù)并與骨髓瘤細胞系SP2/0和小鼠骨髓細胞的染色體計數(shù)進行比較。制備

4、腹水型和上清型雙特異性單克隆抗體，以飽和硫酸銨沉淀法和免疫親和層析法進行純化，Bradford法測定其蛋白濃度，Western blot檢測其免疫特異性，b.v公司的抗體亞型檢測試劑盒測定雙特異性單克隆抗體的Ig類別，ELISA間接法測定其抗體效價及親和常數(shù)。測定pH值對雙特異性單克隆抗體穩(wěn)定性影響實驗，分別以0.05M pH2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液、0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液和0.01MpH7.4磷酸鹽緩沖液將腹水型雙特異性單

5、克隆抗體（以免疫前小鼠血清作陰性對照）作1：10稀釋，4℃靜置24h、48h后，用間接ELISA測定其0D450nm與陰性對照0D450nm的比值。 結(jié)果：自基因工程菌pQE30-V/H-DH5α中提取重組VacA-HpaA融合蛋白，12％SDS-PAGE鑒定后，作為免疫原成功免疫小鼠。經(jīng)兩次細胞融合，HAT選擇培養(yǎng)，抗體檢測篩選，獲得37孔分泌同時抗rVacA和rHpaA雙特異性單克隆抗體的融合細胞孔，經(jīng)克隆化培養(yǎng)得到3株穩(wěn)定

6、分泌雙特異性單克隆抗體的雜交.雜交瘤細胞株，命名為fB8、fC5和fE7，其分泌的雙特異性單克隆抗體均可與純化的rVacA或rHpaA蛋白特異性結(jié)合。fB8雜交-雜交瘤細胞株穩(wěn)定性較好，體外連續(xù)傳30代、反復(fù)凍存復(fù)蘇6次、液氮中凍存1.5個月后復(fù)蘇測定細胞株仍可穩(wěn)定分泌雙特異性單克隆抗體。fB8雜交-雜交瘤細胞染色體計數(shù)為127±5條，而小鼠脾細胞為40條，Sp2/0骨髓瘤細胞為64±3條。三株同時坑rVacA和rHpaA的雙特異性單克

7、隆抗體雜交-雜交次瘤細胞（fB8、fC5和fE7）分泌的抗體均為IgG1。fB8腹水型雙特異性單克隆抗體的效價為5.12×105，蛋白濃度為11.32 mg/ml（Bradford法）。pH值對雙特異性單克隆抗體穩(wěn)定性影響的實驗結(jié)果顯示，酸性和堿性都可使雙特異性單克隆抗體穩(wěn)定性下降。 結(jié)論：初步建立起三株分泌同時抗幽門螺桿菌細胞空泡毒素和粘附素雙特異性單克隆抗體的雜交-雜交瘤細胞株.成功制備并純化了抗VacA和HpaA的雙特異性